大鼠脑卒中相关基因的抑制性差减杂交文库构建

建立寒冷加高盐刺激大鼠脑卒中的大脑组织差异cD NA文库。方法　正常Wistar大鼠随机分为寒冷加高盐刺激的实验组和不予任何处理的对照组。取实验组发生脑卒中和对照组的大脑组织。提取两组组织的mRNA ,按照抑制性差减杂交试剂盒说明进行实验。在三个水平设定了检验差减效率的实验。首先是使用试剂盒提供的骨骼肌mRNA加入外源性PhiX174(HaeⅢ )作为阳性实验组与我们的实验样品进行平行差减 ,用来证明系统正常。其次是采用PCR扩增看家基因GPDH的方法观察本次实验的差减效果。最后在两库随机各挑取 2 88个克隆测序 ,比较相同序列的重复情况。结果　差减各过程符合理论质量要求 ,分别得到一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。卒中库的理论容量是 7.1× 10 4 ,正常库的理论容量是 5 .5× 10 5。差减效率分析表明结果良好。结论　成功地建立了一个脑卒中特异表达基因的片段库和一个正常特异表达基因片段库。为进一步深入研究该大鼠脑卒中模型的基因奠定了基础     

寒冷应激和高盐饮食复合环境因素对大鼠血压的影响

目的应用寒冷刺激及高盐饮食复制大鼠高血压模型，探讨环境因素在高血压发病中的作用。方法100只3月龄的雄性大鼠，随机分成4组1.寒冷组（n=28），动物置于4±2℃的冷环境，每天4小时；2.高盐组（n=28），每天给予8%的盐饲料；3.复合组（n=28），动物在暴露于冷环境的基础上每天还给予8%的高盐饮食；4.正常对照组（n=16），不给任何刺激因素。四组总的实验时间为8周。每周测一次尾压、心率。结果第一周末，寒冷、高盐、复合组的尾压、心率比对照组均明显升高（P\5<0.01），三周末血压达到最高,分别为(127.0±6.0,125.9±5.5,131±6.0)mmHg。结论应用复合环境因素成功地复制了大鼠高血压模型；环境因素对血压有明显影响。     

应激引起大鼠脑卒中时细胞与机体防御基因的表达差异及其在发病学中的意义

目的　探讨应激引起大鼠脑卒中时细胞与机体防御基因的表达差异以及其在发病学中的意义。方法　制备大鼠高血压脑卒中模型,应用抑制性差减克隆技术对卒中样发作鼠(刺激因素组)和正常对照鼠脑(正常对照组)的差异基因进行筛选。经过两轮杂交后,产生的克隆均为脑卒中鼠脑组织特异表达的序列。每组随机挑取2 88个克隆,进行测序及GenBankBlast生物信息分析。结果　两组共有4 5 6个可用序列,我们对每个与已知基因高度同源的序列以功能为参照进行了分类,发现大鼠卒中后脑组织细胞与机体防御基因表达明显下调(P <0 .0 1) ,2 88个克隆中未发现运输蛋白/膜转运及应激反应相关基因的表达。结论　脑组织运输蛋白/膜转运及应激反应相关基因的表达发生改变,可能是脑卒中发生的分子机制之一。     

脑卒中后抑郁大鼠海马、丘脑组织中BNDF、TrkB的表达变化及意义

目的观察脑卒中后抑郁(PSD)大鼠海马、丘脑组织中BDNF及其高亲和力受体原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)的表达变化,并探讨其意义。方法将32只大鼠随机分为正常组、抑郁组、卒中组及PSD组各8只。正常组不干预;抑郁组采用孤养法制作抑郁模型;卒中组及PSD组采用线栓法致局灶性脑缺血(卒中);PSD组加慢性不可预见的中等应激刺激和孤养法制作PSD模型。采用RT-PCR法检测各组大脑海马及丘脑组织中的BNDF mRNA和TrkB mRNA。结果 PSD组海马BNDF mRNA、丘脑TrkB mRNA表达均明显低于对照组(P均<0.05);其余各组海马BNDF mRNA表达、丘脑TrkB mRNA表达比较均无统计学差异。结论 PSD大鼠海马、丘脑组织中BDNF及TrkB表达降低,二者可能参与了PSD的发病。     

RNA指纹法分离血管性痴呆大鼠海马内的差异表达基因

目的：分离血管性痴呆（VD）大鼠海马内疾病相关基因，方法：用改良的Pulsinelli-4血管阻断全脑缺血法4－VO法建立VD模型，Morris水迷宫检测其痴呆，以RNA指纹法对比正常老龄大鼠和血管性痴呆大鼠海马组织基因表达，并分离疾病情况下表达差异的基因。结果：在成功建立VD大鼠模型的基础上，分离、筛选、克隆到32条VD海马内疾病相关差异表达基因片段，选取2条VD特异表达的片段进行Northern杂交验证，通过测序与GenBank比较证均为新基因片段，登录号为BG937392、BG937393，结论：RNA指纹法是快速、简便，有效的分离差异基因的方法，本实验分离的差异表达基因可能是直接参与疾病发生，发展过程的致病基因或保护基因。     

甘氨酸在肝硬化发生发展过程中对肝组织CD14基因及蛋白表达的影响

目的 观察甘氨酸在肝硬化形成过程中对肝组织表达CD14基因和CD14蛋白的影响。方法 采用复合因素建立肝硬化动物模型的同时，实验组分别用甘氨酸液（1g/d)给大鼠灌胃，或用含5%甘氨酸食物喂养大鼠，并于实验的2周末、4周末和8周末以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和western blot法检测大鼠肝组织CD14 mRNA和CD14蛋白的表达。结果 在用含甘氨酸食物喂养的脂肪肝和肝硬化大鼠中，其肝组织CD14 mRNA及CD14蛋白的表达较对照组大鼠明显减弱，其中用含甘氨酸食物喂养8周末的肝硬化大鼠肝组织的CD14 mRNA及CD14蛋白表达最弱。结论 甘氨酸可下调肝组织CD14基因和CD14蛋白的表达。     

高脂饮食联合维生素D3腹腔注射对大鼠动脉组织AUF1及IL-35表达的影响

目的探讨高脂饮食联合维生素D3腹腔注射对大鼠动脉组织AU碱基富集区结合因子1(AUF1)及白细胞介素35(IL-35)表达的影响。方法选择SD大鼠20只随机分为实验组和对照组各10只。给予实验组大鼠高脂饮食及维生素D3腹腔注射,对照组大鼠予以正常饲养。12周后检测比较两组大鼠的血脂水平、动脉组织病变情况;比较两组大鼠动脉组织AUF1 mRNA及IL-35 mRNA及其蛋白表达情况。结果实验组大鼠血清总胆固醇、三酰甘油均显著高于对照组,动脉组织AUF1 mRNA、IL-35 mRNA表达显著高于对照组(P 0. 05)。光镜下,对照组大鼠动脉内膜光滑,中膜平滑肌细胞排列整齐,纤维清晰,边界清楚,无炎症细胞浸润;实验组大鼠主动脉内皮细胞肿胀增厚,中膜平滑肌细胞排列紊乱,局部有轻微增殖等表现,但未见斑块组织。两组大鼠动脉组织AUF1及IL-35的蛋白印迹均未见明显条带。结论高脂饮食联合维生素D腹腔注射能诱发大鼠动脉发生一定程度的炎症反应,对动脉组织的AUF1 mRNA、IL-35 mRNA表达产生比较明显的影响,但对动脉组织IL-35及AUF1蛋白表达并未产生明显的影响,可能与本研究大鼠实验周期较短有关。AUF1、IL-35可作为抗炎症性反应干预的靶点。     

糖尿病大鼠瘦素受体OB-Ra表达的研究

目的 探讨瘦素受体0B-RamRNA在糖尿病(DM)大鼠多个组织中的表达及胰岛素(Ins)分泌减少对其表达的影响。方法 从大鼠脾组织中提取总RNA，采用逆转录PCR技术扩增了约1．44kb的0B-Ra基因片段；以四氧嘧啶诱导DM模型大鼠；检测和比较正常和DM大鼠多个组织中0B-Ra mRNA的表达。结果 0B-RamRNA在大鼠体内广泛表达，脾、睾丸、腹部白色脂肪(简称脂肪)及大脑等组织中表达水平较高，而心、肺中几乎未见表达；DM大鼠的胰腺、脂肪和睾丸等组织0B-RamRNA的表达量与正常大鼠相比，分别减少了62％、15％和11％。结论 DM大鼠体内胰腺、脂肪和睾丸等组织中0B-RamRNA表达量的降低与Ins分泌减少及由此引起的代谢改变有关。     

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶致黑质多巴胺能神经元变性的分子机制的研究

目的：初步研究1－甲基4－苯基－1,2,3,6－四氢吡啶（MPTP）致黑质多巴胺能神经元变性的分子机制,方法：采用MPTP腹腔注射制备帕金森病褐鼠模型,利用mRNA差异显示技术获得在实验组及正常对照组黑质中差异表达的基因片段,应用反Northern杂交去除假阳性,对真阳性的表达序列标签（EST）进行克隆,测序及同源性比较,结果：用1个随机引物和锚定引物对进行差示反应,在实验组获得2个黑质特异表达的EST,其中1个被克隆,测序,为121bp,与人基因abl外显子1b有低的同源性,结论：MPTP致黑质社经元变性可能是通过改变促神经元凋亡基因表达而起作用。     

脑卒中后抑郁大鼠额前皮质神经生长因子的表达变化

目的观察脑卒中后抑郁(PSD)大鼠额前皮质神经生长因子(NGF)及其高亲和力酪氨酸激酶受体A(Trk A)mRNA的表达变化。方法将32只健康成年雌性SD大鼠随机分为正常组、抑郁组、卒中组、PSD组,每组8只。卒中组采用线栓法制备局灶性脑缺血模型;抑郁组采用慢性不可预见的中等应激刺激结合孤养法制备大鼠慢性应激抑郁模型;PSD组采用线栓法制备局灶性脑缺血模型,术后1周加以中等应激刺激及孤养方法制备PSD模型。于造模后第29天各组取0.5 cm厚的大脑额前皮质约100 mg,采用RT-PCR法检测额前皮质组织NGF及Trk A mRNA的表达。结果各组额前皮质组织中均有NGF、Trk A的表达。PSD组NGF mRNA表达低于正常组(P<0.05),其余各组相比NGF mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。各组Trk A mRNA表达差异无统计学意义。结论 PSD大鼠额前皮质NGF mRNA的表达减少,可能与PSD发病有关。     

双黄连抑制流感病毒甲1型基因的研究

目的通过对实时荧光定量RT—PCR检测流感病毒甲1型多聚酶蛋白（PA）基因,了解烈黄连作用病毒的效应。方法采用实时荧光定量RT—PCR法标准曲线测药物抑制甲。型PA病毒基因效应。结果以实时荧光RT-PCR法,重复测7次取平均值,对照组病毒基因为3．62×10^6±0．90拷贝数／ug,试验组病毒基因为4．57×10^5±1．23拷贝数／mg。发现病毒对照组基因明显高于试验组（P〈0．001）。结论提示双黄连可抑制流感病毒甲1基因。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

消减杂交技术在结核病研究中的应用

消减杂交是20世纪80年代应研究真核生物基因差异表达需要而发展起来的一种基因差异筛选方法.抑制性消减杂交是建立在抑制性PCR基础上的一种高效消减杂交技术,最早应用于真核生物mRNA差异表达的研究中.Akopyants等首次将该方法进行改良并用于细菌基因组比较分析.这两种方法在多个领域得以广泛应用.现就其在结核病研究中的应用作一综述.     

瘦素受体基因Gln223Arg多态性与脑卒中相关性的研究

目的探讨瘦素受体(leptin receptor,LR)基因Gln223Arg位点多态性与脑卒中的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法检测50例脑卒中患者和50例正常对照者的LR基因Gln223Arg位点多态性,同时记录受试者年龄、性别,并测定血糖、胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、收缩压和舒张压等临床指标进行对比分析。结果脑卒中组的瘦素受体基因G和A等位基因频率分别为74.0%和26.0%,正常对照组分别为84.0%和16.0%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组基因型比较,基因型中含有等位基因A的各临床指标要高于对照组。结论 LR基因Gln223Arg位点的A等位基因会增加脑卒中的发病风险。     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

Angiotensin converting enzyme DD genotype is associated with development of rheumatic heart disease in Egyptian children

Angiotensin converting enzyme (ACE) gene polymorphism was previously studied in some cardiovascular diseases. There are only few studies which investigated this polymorphism in patients with rheumatic heart disease (RHD). The results of these investigations are inconsistent. Furthermore, gene polymorphism distribution is different in various ethnic populations. We conducted this study to demonstrate this gene polymorphism in Egyptian children with RHD. Leukocytes DNA was extracted from 139 patients with RHD and 79 healthy control children. After amplification by the PCR, the products were separated by electrophoresis in 6% polyacrylamide gel and visualized after ethidium bromide staining with UV light. The PCR product is a 190-bp fragment in the absence of the insertion (D allele) and a 490-bp fragment in the presence of the insertion (I allele). Gene polymorphism was as follows: DD gene when lane contains only 190-bp fragment, II gene when lane contains only 490-bp fragment and ID gene when lane contains both fragments. We found that gene polymorphism in both control and patients groups followed the following order of distribution from highest to lowest: ID, II, DD gene. The frequency in control group was 49.4, 36.7, and 13.9%, respectively. In patients groups, the gene frequency was 42.5, 30.9, and 26.6%, respectively. DD gene frequency differs significantly between the two groups. We concluded that patients with RHD have a higher ACE-DD genotype than normal control. ACE-DD genotype may be a risk factor for RHD in Egyptian children.     

弓形虫感染对大鼠记忆力影响及其机制的实验研究

目的观察弓形虫感染对大鼠学习记忆能力和海马组织细胞因子(白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6)水平以及大脑皮层一氧化氮合酶(NOS)活性的影响,探讨其可能机制。方法40只清洁级SD大鼠随机分成4组,即对照组和高、中、低感染剂量的弓形虫感染组(2×107/ml×2ml、2×105/ml×2ml、2×103/ml×2ml)。9周后进行被动回避实验和Morris水迷宫试验,观察弓形虫感染对大鼠的学习记忆能力等行为学变化。放射免疫法检测大鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平,免疫组化检测NOS活性。结果弓形虫感染对大鼠的记忆获得没有影响,但高、中剂量弓形虫感染组大鼠的记忆消失要早于对照组(P<0.05),低感染剂量组大鼠记忆消失与正常对照大鼠比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各感染组大鼠Morris水迷宫测试中逃避潜伏期均明显延长,其距离百分比明显降低(P<0.05)。各感染组大鼠海马组织IL-1β、TNF-α水平明显高于对照组(P<0.05);但IL-6水平与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。感染组大鼠大脑皮层NOS阳性细胞数增加。结论弓形虫感染对大鼠的学习记忆能力有影响,其作用机制之一可能与大鼠海马组织IL-1β、TNF-α细胞因子水平升高有关。