含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用

目的　构建ＩＦＮ－γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂,观察其与ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１（ｐｃ－ＲＯＰ１） ＤＮＡ共同免疫小鼠所诱导的免疫应答。方法　将ＩＦＮ－γ基因片段定向插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,双酶切鉴定,获得ｐｃＩＦＮ 重组子;碱裂解法大量制备,经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射ｐｃＩＦＮ、ｐｃ－ＲＯＰ１ 各１００μｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第３０ 天、５０ 天、７０天共三次用ＭＴＴ法测定小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖活性及ＮＫ细胞活性;双夹心ＥＬＩＳＡ 测定血清细胞因子ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及酶法测定ＮＯ含量;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　构建成功的作用下,该两项指标均明显提高,且ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２ 及ＮＯ水平均较不加佐剂组显著提高（Ｐ＜ ０．０１）;而对ＩｇＧ抗体滴度无显著影响（Ｐ＞ ０．０５。结论　ＩＦＮ－γ基因佐剂具有协同ｐｃ－ＲＯＰ１ＤＮＡ免疫的作用,可增强免疫鼠细胞免疫应答,ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２细胞因子及ＮＯ的产生     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：Ⅳ …

用ｐｃ－ＲＯＰ１重组质粒免疫小鼠,观察其对细胞因子ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及ＮＯ的影响。方法碱裂解法大量制备ｐｃ－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ,经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射１００μｇ,两周后同量加免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第３０天、５０天、７０天共三次用双夹心ＥＬＩＳＡ测定血清细胞因子ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２含量;酶法测定ＮＯ活性。结果三次检测免疫组ＩＮＦ－γ、ＩＬ     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段,克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１;经亚克隆,筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒,亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒,为下一步研究奠定了基础     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的　用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法　碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射１００ｕｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０ 天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清ＩｇＧ抗体９０天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异。结论　ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ 免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生ＩｇＧ抗体     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒, 直接免疫小鼠, 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒, 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠, 每鼠注射１００ μｇ,２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次, 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性; 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目;ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后, 脾脏明显增大; 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群, ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化, 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果, 与对照组相比较, 无明显增高; 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高, 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠, 可诱导产生细胞及体液免疫应答。     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：Ⅲ免 …

用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＰＯＰ１真核表达重组质粒，经肌肉注射免疫小鼠，观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只鼠，注射１００ｕｇ，两周后同时加强免疫一次，以ｐｃＤＮＡ３空间粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０天用间接免疫酶法检注射局部肌组织重组蛋白的表达ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果免疫鼠肌组织     

HBV.CP—β—IFN真核表达载体的构建及鉴定

目的 扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,将其与β－干扰素基因进行连接,以构建真核表达载体,为下一步研究表达打下基础。方法 ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,产物经ＤＮＡ自动测序正确后,与表达干扰素的ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ质粒进行粘端连接,并对构建真核表达载体进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果 扩增出ＨＢＶ,ＣＰ,序列与报告资料基本一致;与ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ真核表达载体。     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：I.pcDNA3 …

目的 构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法 用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果 从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出     

弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠, 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ, 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度; 免疫鼠血液组织 Ｐ３０ 基因 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增; 弓形虫攻击感染。结果　用 Ｅ Ｌ Ｉ Ａ Ｓ 法检测的抗体 Ｉｇ Ｇ 滴度１∶２５６０ , 免疫后３ 周及６ 个月从免疫鼠血液组织中检测到 Ｐ３０ 基因;攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（ Ｐ＜ ００５） , 结论　重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠可诱导一定的体液免疫应答, 对抗攻击感染具有一定的保护性。     

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组ＤＮＡ;据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段,插入ｐＢＶ２２０质粒,转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞,于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符,约７５６ｂｐ;构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ,表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因,并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒,诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株pcDNA3—EBA175／HRPII重组质粒直？…

为观察恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ重组质粒肌肉途径接种后在宿主体内的表达。ＢＡＬＢ／ｃ小鼠分为３组,１组（实验组）经后腿股四头肌注射重组粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ１００μＧ;２组（实验对照组）注射空白质粒ｐｃＤＮＡ３１００μＧ,３组（正常对照组）注射ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μｌ。每隔２０ｄ加强注射,于第１次接种后２０ｄ和第２次接种后１０ｄ取小鼠双侧     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

恶性疟原虫MSP1_(19)与PfCMR基因的体外重组与克隆鉴定

目的：构建编码恶性疟原虫复合多价保护性抗原的基因的重组质粒,为进行基因免疫提供条件。方法：设计一对特异引物Ｐ１与Ｐ２,采用ＰＣＲ法扩增获取ＭＳＰ１中Ｃ端１９肽基因,纯化后用ＳａｌⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切,把含复合基因ＰｆＣＭＲ的重组质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ用ＥｃｏＲⅠ＋ＳａｌⅠ双酶切,回收复合基因ＰｆＣＭＲ,将ＭＳＰ１１９基因与ＰｆＣＭＲ基因串联后与经ＥｃｏＲⅠ＋ＸｂａⅠ双酶切的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３进行重组,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,经电泳初筛、双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增获得３６３ｂｐ的ＭＳＰ１１９基因,重组克隆经双酶切鉴定及ＰＣＲ鉴定后获得正确重组克隆子ｐｃＤＮＡ３－ＰｆＣＭＲ－ＭＳＰ１１９（命名为ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８）,Ｐｆ８基因长度为６１８ｂｐ。结论：成功构建编码恶性疟原虫多价保护性抗原的基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８。     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达，为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２，Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达，将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液应答及保护性研究

目的 用重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐ３０免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,观察其ＤＮＡ免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法：大量制备闰ＤＮＡ,肌肉注射免疫小鼠。ＥＬＩＳＡ测定ＩｇＧ抗体滴定,免疫鼠血液组织Ｐ３０基因ＰＣＲ扩增,弓形虫攻击感染。结果 用ＥＬＩＡＳ法检测的抗体ＩｇＧ滴度１：２５６０,免疫后３周及６个月从免疫鼠血液组织中检测到Ｐ３０基因;攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（Ｐ〈０．０５）,     

恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA_3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答

目的　探讨恶性疟原虫ＤＮＡ 疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法　将恶性疟原虫ＦＣＣ－ １／ＨＮ株有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌途径注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,对注射部位的骨骼肌进行了预处理,即于注射前７ｄ 先在左后肢股四头肌注射０．５％ 盐酸布比卡因５０μｌ,注射深度为２ｍ ｍ 。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ４＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值和ＮＫ 细胞杀伤活性的变化。结果　１）重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经肌肉注射途径免疫小鼠后,机体ＩｇＧ抗体滴度增高、特异性Ｔ淋巴细胞增殖反应增强、ＣＤ８＋ Ｔ细胞亚群比值增高以及ＮＫ细胞杀伤活性增强。２）肌肉注射为一有效的ＤＮＡ疫苗免疫途径。结论　采用编码有性期基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ Ｐｆｓ２５ 经骨骼肌注射途径免疫小鼠,能诱导机体有效的体液免疫、细胞免疫和ＮＫ细胞杀伤活性。本研究为恶性疟ＤＮＡ疫苗的研究提供了免疫学实验依据     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

人类HLA—B7可诱导启动子调控IRES连接的人TNFα和IFN？…

目的：为增强肿瘤细胞表面ＭＨＣＩ类分子表达，并调动免疫系统更有效地抑制和杀伤肿瘤细胞，构建在ＨＬＡ－Ｂ７启动子调控下，ＩＲＥＳ连接的人ＴＮＦα和ＩＦＮβ基因的重组逆转录病毒载体，方法与结果：将ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ（＋）中，改换酶切位点后定向克隆入含ＨＬＡ－Ｂ７启动子的质粒中，构建成ｐＧＬ３Ｂ７ＴＮＦ。ＩＦＮβｃＤＮＡ经定向插入ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）改换酶切点切下，定向克     

日本血吸虫（中国大陆株）磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶ＤＮＡ疫苗诱导Ｃ５７ＢＬ／６小 保护性免疫作用。方法 分别以ｐＵＣ１９－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ１．１－ＩＬ－１２为模板设计引物。将ＰＣＲ扩增到的ＳｊＣＴＰＩ基因以及ＩＬ－１２的亚单位Ｐ３５和Ｐ４０基因克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ．３．１中大量制备ｐｃＤ－ＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的质粒ＤＮＡ,把４５只５～６周龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分成３组。对照组（ｐｃＤＮＡ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１;实验组（ＴＰＩ组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ;加强组（ＴＰＩ＋ＩＬ－１２组）肌肉注射１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－ＳｊＣＴＰＩ及１００ｕｇ的ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ３５和ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ４０的混合物     

乙型病毒S基因单独和与白细胞介素—12基因联合免疫小鼠诱生的体液免疫应

以ＰＣＲ技术扩增得到乙肝病毒表面抗原的编码基因,构建Ｓ基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｓ。以ＰＣＲ方法扩增得到小鼠白细胞介素－１２的全长ｃＤＮＡ序列,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ－１２（以下简称ＩＬ－１２）。以Ｓ和Ｓ＋ＩＬ－１２经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,以空载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋为阴性对照,血源ＨＢｓＡｇ蛋白为阳性对照,用ＥＬＩＳＡ方法检测下同时间免疫小鼠血清中的抗０－ＨＢｓ