微小牛蜱磷酸丙糖异构酶基因片段的克隆与原核表达

为克隆和表达微小牛蜱磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,Tim)编码基因,提取微小牛蜱成虫总RNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其连入pMD-18T载体,经酶切和测序鉴定后,将正确的目的基因与pET-28a表达载体连接,并转入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta(DE3)中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分析。结果发现,克隆所得的微小牛蜱成虫tim基因片段长度为750bp(登录号为JX112888),其中开放阅读框为750 bp,编码249个氨基酸,与微小牛蜱胚胎中克隆出的tim基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Tim相对分子质量(Mr)约为27 000。     

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构观察

本文对土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构进行了描述。尾蚴皮层从外向内由糖蛋白膜、外质膜、皮层基质、基质膜、基底膜组成。皮层基质为一较厚的致密层,无细胞界线及其它亚细胞结构,充满致密的细颗粒性物质。此层厚度变化较大,而致虫体表面凸凹不平。有两型致密体分布于皮层基质中。     

土耳其斯坦东毕吸虫成虫cDNA文库的构建

按照SMARTcDNA文库构建试剂盒说明 ,以TRIZOL试剂提取的土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA为模板 ,以含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)为引物反转录合成第一链cDNA ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA 5’端延伸出去的模板 ,采用LD -PCR技术以改良的oligo(dT)引物合成双链cDNA ,经蛋白酶K和SfiⅠ消化后 ,过CHROMASPIN - 4 0 0柱进行分级分离。双链cDNA与载体λTripEx2两臂连接 ,体外包装后构建成土耳其斯坦东毕吸虫成虫的cDNA噬菌体表达文库。经测定文库容量为 6 38× 10 6,文库扩增后的滴度为 3 4 8× 10 10 (Pfu/ml) ,PCR测定的重组率为 92 %。各项指标表明 ,我们成功的构建了高质量的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆保护性抗原基因奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的染色体C带核型表明:在雌性虫体,第1号染色体的短臂可见到一异染色质块。第2号性染色体的Z染色体不易出现C带,而W染色体从着丝点部位向长臂方向恒定的出现一大块异染色质。第3号、5号染色体不是恒定的出现C带。第4号染色体的端着丝粒非常明显。第6号、7号染色体在长臂末端分别可以见到一对异染色质块。在雄性.可清楚地见到2号性染色体为同形性染色体,两条同源染色体都没有异染色质出现。其它染色体的C带同雌性虫体。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶小鼠免疫试验

目的：探讨从日本血吸虫大陆株成虫分离的天然磷酸丙糖异构酶抗原（ＳｊｃＴＰＩ）免疫小鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用。方法：采用丙酮沉淀法从日本血吸虫大陆株成虫中提取天然的ＴＰＩ抗原，并以所提纯的ＳｊｃＴＰＩ抗原加福氏佐剂经皮下和肌肉注射免疫ＮＩＨ小鼠，攻击感染后６ｗｋ收集小鼠血清并计数成虫负荷及肝、肠组织虫卵数。同时设有日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）免疫对照组和攻击感染对照组。结果：天然ＳｊｃＴＰＩ抗原免疫小鼠后减虫率为２１．４％－２５．０％，肝组织减卵率达５７．８％－６０．３％；ＥＬＩＳＡ法检测ＴＰＩ免疫小鼠血清抗ＴＰＩ抗体ＯＤ值明显高于对照组小鼠的ＯＤ值（Ｐ＜０．０５）。结论：天然的ＳｊｃＴＰＩ抗原具明显的免疫原性和抗原性，可以继续进行编码ＴＰＩ基因的克隆与表达。     

牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫ITS和28S rDNA-LSU序列分析

目的探讨牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）核糖体内转录间隔区（ITS）和28S核糖体大亚基序列（rDNA-LSU）的差异。方法粪便检查、剖杀自然感染东毕吸虫的绒山羊、山羊、绵羊和黄牛,收集虫体,形态学鉴定为土耳其斯坦东毕吸虫。抽提成虫基因组DNA,扩增其ITS（包括ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2）和28S rDNA-LSU序列,测序并分析以上序列,以及28S rDNA-LSU序列RNA二级结构。结果牛、羊源土耳其斯坦东毕吸虫的ITS-1、5.8S rDNA、ITS-2和28S rDNA-LSU序列分别长384、159、331和1304bp。牛源和羊源的ITS-1和5.8S rDNA序列完全相同;黄牛源、绵羊源和绒山羊源的ITS-2序列完全相同,与山羊源存在1个碱基的差异;绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列完全相同,与牛源和山羊源分别有2个碱基的差异。绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列RNA二级结构相同,与山羊源存在微小差异,但牛源与羊源存在较大差异。结论不同终末宿主源土耳其斯坦东毕吸虫的核糖体序列存在不同程度的差异,羊源28S rDNA-LSU序列的RNA二级结构相同或相似,但与牛源存在较大差异。     

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。     

基于磷酸丙糖异构酶基因序列的蓝氏贾第鞭毛虫分子系统发育的研究

[目的 ]探讨蓝氏贾第鞭毛虫种内系统发育及遗传多样性。 [方法 ]对不同来源虫株的磷酸丙糖异构酶(tim)基因进行 PCR扩增、序列测定后 ,用简约法和 NJ法构建分子系统树进行系统学分析。 [结果 ]在所测序列中共有 12 4个位点存在变异 (2 3% ) ,且大多数为发生在第三密码子的同义突变 ,两种构树方法所得两树的分枝结构相似 ,均将受试的 16株蓝氏贾第鞭毛虫分为明显的两组。 [结论 ]tim基因可作为研究蓝氏贾第鞭毛虫群体遗传结构一个有效的遗传标记     

中国大陆两种东毕吸虫rDNA-LSU基因的序列分析

目的　测定程氏东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫结节变种rDNA LSU基因序列 ,并对照已发表的土耳其斯坦东毕吸虫同一基因序列 ,比较三者的差异 ,探讨东毕吸虫虫种分类问题。　方法　收集两虫种成虫 ,GNT K法抽提基因组DNA ,PCR扩增目的基因 ,并将其产物克隆入质粒再次扩增 ,提取质粒DNA ,以M 13(F/R)作为测序引物进行测序。从GenBank获得土耳其斯坦东毕吸虫rDNA LSU基因序列 ,用BioEdit软件将 3种血吸虫基因序列排序并比较分析。　结果　程氏东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫结节变种的LSU序列完全一致 ,与土耳其斯坦东毕吸虫rDNA LSU基因序列仅相差一个碱基 ,同源性高达 99.99%。　结论　γDNA LSU基因序列分析结果不支持程氏东毕吸虫为独立种 ,土耳其斯坦东毕吸虫结节变种可能是土耳其斯坦东毕吸虫的同种异名。     

弓形虫胚层发育相关蛋白基因的克隆和序列分析

目的 对15个弓形虫虫株的弓形虫胚层发育相关蛋白(TgERP)基因进行克隆和序列分析,了解其变异和进化情况,为评价该蛋白在血清学诊断和疫苗防疫应用上的价值提供理论基础。方法 设计TgERP基因的PCR引物,对15个弓形虫虫株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Puzzle 5.2、Paup 4.0和DNAStar 5.0软件进行分析。结果 TgERP基因包含的完整开放阅读框(ORF)长度均为315 bp,A+T含量在46.67%～46.98%之间,仅有1个碱基发生变异,变异率为0%～0.32%。编码104个氨基酸,变异率在0%～0.96%之间。系统进化分析显示,TgERP基因序列虽然能够将弓形虫I型虫株与II/III型虫株区分开,但却不能区分所有基因型的虫株。结论 TgERP基因在各基因型虫株中十分保守,不适合作为遗传标记分子来区分不同基因型的弓形虫虫株。     

大鼠源卡氏肺孢子菌p55抗原基因克隆和序列分析

目的克隆大鼠源卡氏肺孢子菌55kDa抗原（p55）基因。方法取肺孢子菌病大鼠肺组织制备肺孢子菌DNA，并以此模板扩增p55基因，将PCR产物与pGEM—T载体连接．转化E．coli DH5a．在含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上筛选出重组子，提取质粒进行PCR扩增、酶切鉴定、序列测定及序列比较分析。结果p55基因体外扩增产物长度为l286bp，重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子，测序结果与文献报道同源性为99．8％。结论成功扩增了p55基因，并插入克隆载体pGEM—T中。p55基因的克隆为进一步建立基因分型、疫苗等研究打下基础。     

细粒棘球蚴线粒体CO1基因的克隆与序列分析

目的 研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,为该虫种的分子分类学研究提供基础。方法 在内蒙古地区从羊肝脏采集细粒棘球蚴,肝包虫病患者手术剥离囊包后,签署知情同意书,采集细粒棘球蚴。提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序,运用DNAstar5.0 软件计算序列间的相似性,计算遗传距离,同时,应用MEGA4.0软件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和邻接法(NJ-Neighbor Joining)构建系统发育树,进行聚类分析。结果 细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株CO1基因序列片段长度为936 bp。同其他亲缘关系较近的属CO1基因序列比对:羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫的同源性最高,分别为91.9%、91.2%;羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,均为100%。羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列所属分支与原头目的Proteocephalus macrocephalus所属分支相隔较远。结论 CO1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记。     

细粒棘球蚴线粒体nad1基因的克隆与序列分析

目的 为完善细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)的分子分类学体系,提供更优化的种间和种内遗传标记基因。方法 在内蒙古地区采集患羊肝脏细粒棘球蚴和肝包虫病患者棘球蚴。采用提取虫体DNA的方法,扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因并进行测序,运用DNAstar5.0软件构建系统发育树并采用MEGA4.0软件进行自居检验。结果 细粒棘球蚴DNA 扩增出的羊株、人株nad1基因序列片段长度为895 bp。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫的同源性最高,相似性为86.5%;羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,为100%。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列所属分支与裂头目、裂头科Diplogonoporus balaenopterae所属分支相隔最远。结论 nad1基因有较高保守性,同时也存在种间差异,可广泛应用于研究细粒棘球绦虫的种间和种内遗传变异。     

刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列，并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸，发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析，设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA)，使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp，推导翻译出的蛋白质有316个aa组成，约35kDa，与预期大小接近。保守功能域分析表明，弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH，其准确定名缩写为LDH-like MDH，同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外，还与很多细菌等物种同源，但与人的同源性最低(22％)。弓形虫MDH cDNA序列在NGBI GenBank中登录号为AY650028，对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类，该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白间的同源性很低，提示基于MDH蛋白作为药靶，经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。     

马鹿布氏杆菌25kDa外膜蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆马鹿布氏杆菌ML分离株25kDa外膜蛋白(Omp25)基因,并在大肠杆菌中表达。方法运用RT-PCR技术从马鹿布氏杆菌分离株中扩增出Omp25基因,将其克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定和遗传变异分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。结果该基因全长642bp,编码213个氨基酸;其中前23个氨基酸残基构成信号肽。在推导的氨基酸序列中,存在两个跨膜区,但没有潜在的N-联糖基化位点。与GenBank中已经登录的布氏杆菌其他11个分离株相比,马鹿布氏杆菌分离株Omp25基因变异较小,以散在的点突变为主,Omp25基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.1%-99.4%和99.2%-99.5%之间。转化重组质粒pETOMP25的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出具有反应原性的目的蛋白,表达量占菌体蛋白的18.6%。结论马鹿布氏杆菌分离株与流产型布氏杆菌其它分离株Omp25基因同源性很高,可能是一个毒力较强的野毒株。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因的克隆、序列分析及线性B细胞表位预测

目的克隆中国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)编码区全长基因,并对其进行生物信息学分析。方法自间日疟原虫抽提RNA,根据已知的PvLDH基因设计特异性引物,采用RT-PCR扩增PvLDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定,利用生物信息学在线工具对序列进行分析并做B细胞表位预测。结果 PCR产物电泳结果显示所克隆的基因为951bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异。在线分析预测出12个B细胞表位,与恶性疟原虫乳酸脱氢酶预测表位对比分析,发现一个PvLDH特异性表位。结论成功克隆了我国间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因,并预测出1个PvLDH特异性线性B细胞表位。     

谷跗线螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

目的揭示谷跗线螨Tarsonemus granarius体内存在泛变应原精氨酸激酶(arginine kinase,AK).方法 从空调滤网灰尘中采集谷跗线螨(约6 000只)并提取总RNA,反转录为cDNA,设计简并引物,PCR克隆谷跗线螨AK片段,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性.结果 测序和序列分析结果表明,谷跗线螨AK基因的开放阅读框由724个碱基组成,其编码的蛋白相对分子质量约为26 019,等电点为10.10.结论 成功克隆了谷跗线螨AK基因,为进一步谷跗线螨AK蛋白的重组表达以及过敏原性分析奠定基础.