血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠:高压氧干预促进治疗性血管生成

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后梗死区周边心肌的缺血、缺氧、炎性反应、细胞凋亡等病理变化严重影响到移植骨髓间充质干细胞的存活,而高压氧能显著改善其缺氧状态。目的:对心肌梗死模型大鼠缺血心肌局部移植血管内皮生长因子修饰的骨髓间充质干细胞,在移植后对大鼠进行高压氧干预,探讨其对骨髓间充质干细胞移植后所获得的治疗性血管生成效应的影响。方法:将真核表达载体pcDNA3.1(-)/人血管内皮生长因子165转染大鼠骨髓间充质干细胞,再移植至心肌梗死模型大鼠的缺血区组织,移植前细胞行CM-DiI标记。移植后2周每日对大鼠行高压氧治疗干预。移植1个月后行心脏B超测量其左室射血分数,组织化学苏木精-伊红染色和Ⅷ因子染色并评价新生血管密度。结果与结论:CM-DiI能有效标记骨髓间充质干细胞,标记率近100%。细胞移植1个月后高压氧干预的大鼠射血分数、再生血管密度较均明显增高(P<0.05)。证实,高压氧干预能显著促进移植血管内皮生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的心肌梗死大鼠所获得的治疗性血管生成作用,对心脏功能有明显改善作用。     

自体骨髓间充质干细胞移植急性心肌梗死犬血管内皮生长因子及血管新生的变化

背景:研究表明骨髓间充质干细胞在体内外可诱导分化为心肌样细胞,局部移植骨髓间充质干细胞可以促进血管新生,阻止心室重构,改善心功能,但具体机制尚未阐明.目的:探讨骨髓间充质干细胞心肌移植后犬体内血管内皮生长因子的表达变化以及对心肌梗死区血管新生的影响.方法:健康杂种犬随机分成实验组和对照组,均建立急性心肌梗死模型.建模后一二小时,实验组犬将BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液注入心肌梗死区四五个不同部位,对照组注入等量的DMEM.骨髓间充质干细胞移植4周后,酶联免疫吸附测定法检测血清中的血管内皮生长因子浓度,并采用免疫组化染色法进行毛细血管密度测定.结果与结论:移植后第1天及1,2,3,4周血管内皮生长因子的浓度实验组与对照组相比均增加(P < 0.01),且两组血管内皮生长因子的浓度均随时间呈下降趋势(P < 0.01);心肌梗死区单位面积毛细血管数实验组较对照组明显增加(P < 0.01).结果表明心肌梗死区移植骨髓间充质干细胞后使得体内血管内皮生长因子的浓度增加,并可促进心肌梗死后毛细血管新生.     

不同种类自体骨髓干细胞移植对梗死心肌左室重构的效果比较

背景:骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,目前用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞等,不同种类的骨髓干细胞移植后的效果及具体机制尚不清楚。目的:比较自体骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞冠状动脉移植对急性心肌梗死后心室重构的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/2006-12在河北省人民医院临床研究中心、河北医科大学电镜室及大连宝生物进行。(basic fibroblast growth factor,bFGF)材料:36只冀中白猪随机分为4组:假手术组6只、模型组10只、骨髓单个核细胞组10只、骨髓间充质干细胞组10只。方法:采用梯度密度离心法分离培养猪自体骨髓单个核细胞,以贴壁法分离培养猪自体骨髓间充质干细胞,移植前均行胶体金标记。除假手术组外,其余3组均以球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法建立猪急性心肌梗死模型。造模后90min,经导管由冠状动脉腔内骨髓单个核细胞组移植自体骨髓单个核细胞(6.0±1.3)×107个,骨髓间充质干细胞组移植自体骨髓间充质干细胞(4.5±2.1)×107个,培养28d。主要观察指标:光镜及电镜观察心肌组织病理学改变;超声检查心功能变化;免疫组织化学检测心肌血管数、心肌细胞凋亡、心肌组织核因子κB及肌钙蛋白I阳性表达情况,及其与心功能的关系;RT-PCR法检测心肌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA的表达,及其与心功能的关系。结果:①骨髓间充质干细胞组在梗死区、梗死边缘区均可见大量血管增生,冠脉血管周围可见异常细胞团生长,骨髓单个核细胞组有较多的毛细血管"芽生"现象。②细胞移植前各组心功能指标基本相似(F=1.550,P>0.05)。移植后28d与模型组比较,其余3组左心室射血分数均明显降低(F=5.30,P<0.05)。③与模型组比较,骨髓单个核细胞组梗死区及梗死边缘区的血管数明显增加(F=29.56～34.87,P<0.01),骨髓间充质干细胞组无变化;移植细胞两组的梗死区、梗死边缘区心肌细胞凋亡率均显著降低(F=14.31～35.34,P<0.01),肌钙蛋白I阳性率均明显升高(F=19.05,P<0.01);梗死边缘区核因子кB阳性率均明显降低(F=19.05,P<0.01)。④骨髓单个核细胞组梗死边缘区VEGF基因的表达显著高于模型组、骨髓间充质干细胞组(F=49.41,P<0.01)。骨髓间充质干细胞组梗死边缘区bFGF基因的表达显著高于模型组、骨髓单个核细胞组(F=4.71,P<0.01)。⑤左室射血分数与心肌细胞凋亡率、心肌核因子κB呈负相关(r=-0.4411,P<0.05;r=-0.5796,P<0.01);与血管数、VEGF及bFGF表达呈正相关(r=0.775,P<0.01;r=0.5651,P<0.05;r=0.5735,P<0.05)。结论:经冠脉自体骨髓单个核细胞或骨髓间充质干细胞移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量及心肌VEGF,bFGF表达、减少心肌细胞凋亡及核因子κB水平有关。骨髓单个核细胞移植促心肌血管增生及VEGF的表达均优于骨髓间充质干细胞,而后者促bFGF基因表达的作用优于前者。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,但目前尚不能清楚阐述骨髓间充质干细胞移植促进神经功能恢复的相关机制.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在中国医科大学神经生物学实验室完成.材料:健康Wistar大鼠75只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离培养,72只随机分为3组:假手术组(n=18)、DMEM组(n=27)、骨髓间充质干细胞组(n=27).方法:以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.参照Nystrom's压迫方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓.模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射.主要观察指标:应用RT-PCR法和应用免疫组织化学技术检测损伤脊髓组织内血管内皮生长因子的表达和分布变化.结果:假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达.骨髓间充质干细胞组在细胞移植后l,3,5d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM组(P<0.05),移植后7,14d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间.     

转染血管内皮细胞生长因子基因骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死区血管新生的影响

背景:骨髓间充质干细胞作为基因载体,有利于外源基因保持良好的遗传稳定性,如能将血管内皮细胞生长因子基因转入间充质干细胞内移植到心肌梗死区,可望获得基因和细胞治疗相互协同促进的作用.目的:观察转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死区血管新生及血管内皮细胞生长因子基因的体内表达.设计、时间及地点:实验于2004/2007年在湖南省儿童医院儿科研究所,中南大学湘雅二医院中心实验室完成的随机对照实验.材料:实验动物为雄性清洁级Wistar近交系大鼠.以冠脉结扎法制备人鼠心肌梗死模型.方法:以密度梯度离心与贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞.当问充质干细胞生长汇合率为80%～90%时以脂转法转染pcDNA3.1-hVEGF165质粒.心肌梗死模型大鼠随机分4组进行干预:联合组于心肌梗死区移植转染血管内皮细胞生长因子基因的间充质干细胞,细胞组移植间充质干细胞、基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液.主要观察指标:移植4周后,各组大鼠心肌梗死区毛细血管密度,血管内皮细胞生长因子基因表达.结果:火鼠心肌梗死区毛细血管密度以联合组和基因组最高,高于细胞组(P=0.001,0.029),细胞组高于对照组(P=0.028).RT-PCR显示血管内皮细胞生长因子基因体内的表达从高到低依次为联合组、基因组、细胞组和对照组.结论:①作为血管内皮细胞生长因子基因的载体,骨髓间充质干细胞有利于其的稳定表达.②转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植有利于大鼠心肌梗死区的血管新生,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗.     

BMSCs移植后脊髓损伤大鼠VEGF表达的变化

目的观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响。方法以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质千细胞。压迫法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓。模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射。结果假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达。骨髓间充质干细胞组在细胞移植后1,3,5 d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM(P0.05),移植后7,14 d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P0.01)。结论骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间。     

自体骨髓间充质干细胞移植心肌梗死区后细胞因子分泌和血管新生及心肌细胞凋亡的变化

目的:经冠状动脉途径行自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死已有较多改善心功能的肯定结论.实验拟验证骨髓间充质干细胞自体移植心肌梗死犬的细胞因子分泌情况,及其对血管新生和心肌细胞凋亡的作用.方法:实验于2005-12/2007-05在安徽医科大学第一附属医院动物实验室和中心实验室完成.选择健康杂种犬36只,无菌抽取犬骨髓液10 mL,经Percoll液密度梯度离心后贴壁法体外培养骨髓间充质干细胞,传2代后行5-氮胞苷诱导,5-溴脱氧尿苷标记备用.结扎冠状动脉途左前降支建立急性心肌梗死模型,术后随机分为细胞移植组、模型对照组,12只/组.细胞移植组分别在梗死区边缘4个不同部位点局部注射植入骨髓间充质干细胞悬液2 mL,模型对照组在相同对应部位注射等量DMEM培养基.术后取心肌梗死组织进行指标检测.结果:①经流式细胞仪检测,传至第3代后的骨髓间充质干细胞CD34和CD11b阳性率小于5%,CD44和CD105阳性率高达90%以上.②原位末端标记结果示,细胞移植组心肌细胞凋亡指数显著低于模型对照组(P < 0.01).③免疫组织化学检测显示,移植后2周细胞移植组梗死区微血管密度明显高于模型对照组(P < 0.05);随移植时间的延长,细胞移植组梗死区新生微血管密度逐渐增加,趋势检验差异有显著性意义(F=439.588,P < 0.01).移植后1,2,4周与模型对照组比较,细胞移植组心肌梗死区血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的表达均显著升高(P均 < 0.01).结论:自体骨髓间充质干细胞移植心肌梗死犬后,能分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子,诱导血管新生,同时抑制心肌细胞凋亡.     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移

背景:外周静脉移植间充质干细胞只有1%～5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。目的:观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。方法:采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3～5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3d和移植后3d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。结果与结论:荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P>0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P<0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子,其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主,具有强烈的促血管新生作用。目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞,继而分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离提取50gSD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定,将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV．EFla,采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果与结论：转染后12h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,48h后表达增多,72h后达到高峰,其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响

背景:缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的.目的:观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响.方法:贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3～5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达.将骨髓间充质干细胞分四组:常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h).RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子mRNA表达水平,ELISA检测骨髓间允质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平.结果与结论:同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P<0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P<0.05).证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素.     

血管内皮生长因子通过CXCR4增强间充质干细胞的趋化能力

目的探索血管内皮生长因子能否通过促进间充质干细胞高表达CXCR4而增加其趋化能力。方法体外培养间充质干细胞铺满约90%时,给与血管内皮生长因子刺激,然后在不同的时间点,用流式细胞术检测间充质干细胞胞内表达CXCR4的变化。CM-DiI标记预先经过及未经过血管内皮生长因子处理的间充质干细胞,通过尾静脉注射到肝损伤小鼠体内,并通过CM-DiI的荧光强度比较来明确趋化到肝脏的间充质干细胞数量的差异。结果经过血管内皮生长因子刺激后,原来低表达CXCR4的间充质干细胞高表达CXCR4。而且在6小时的时间点,CXCR4表达量最高。经刺激后高表达CXCR4的间充质干细胞趋化能力得到提高。结论血管内皮生长因子上调CXCR4的表达,增强间充质干细胞的归巢及趋化能力。     

法舒地尔联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死:有协同治疗作用吗?

背景:RhoA激酶抑制剂法舒地尔能有效抑制心肌梗死后的心肌肥大.目的:观察法舒地尔联合骨髓问充质干细胞移植对急性心肌梗死模型鼠心功能的影响,探讨两者是否具有协同治疗作用.方法:体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞,另选取42只雌性SD大鼠结扎前降支,建立急性心肌梗死模型,随机分成3组.干细胞组,干细胞+法舒地尔组梗死心肌中移植骨髓间充质千细胞,干细胞+法舒地尔组同时给予法舒地尔治疗,梗死组不干预.4周后.以二维超声心动图分析心功能变化,SRY-PCR检测大鼠Y染色体上特有的基因SRY,Western-Blot 检测RhoA蛋白表达,并进行病理观察.结果与结论:与梗死组比较,于细胞组和联合组左室舒张末内径及左室收缩末内径均显著减小(P<0.01),射血分数均显著升高(P<0.01).其中干细胞+法舒地尔组变化幅度优于细胞移植组(P<0.05).干细胞组和联合组基因有SRY表达,梗死组未榆测到基因SRY.干细胞+法舒地尔组RhoA蛋白表达水平较梗死组、干细胞组显著降低(P<0.05).病理观察干细胞组和联合组心肌修复优于梗死组,干细胞+法舒地尔组较干细胞组明显.结果表明单纯骨髓问充质干细胞移植以及法舒地尔联合骨髓间充质干细胞移植均可改善心肌梗死大鼠心功能,减少心室扩张程度,两者联合情况下效果最佳,对心肌梗死具有协同治疗作用.     

骨髓间充质干细胞与丹酚酸B预处理内皮祖细胞共移植对急性心肌梗死大鼠心功能及分化基因表达的影响

背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法.骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境. 目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供.丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号 20060601.方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞.剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只.假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型.结扎冠状动脉15 min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250 μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250 μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射:骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液.主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-time PCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达.结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P＜0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05).细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4 mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5 mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能.     

表达hVEGF121/EGFP融合蛋白骨髓间充质干细胞的制备及缺氧干预

目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的人血管内皮细胞生长因子121的真核质粒,检测所制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮细胞生长因子的水平.方法:设计携带酶切位点的扩增引物,通过PCR技术扩增人血管内皮细胞生长因子121编码基因全序列,以粘端连接克隆法将其编码片段定向连接入质粒载体pEGFP-N2的多克隆位点中,构建pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒,采用酶切法、PCR以及DNA序列测定法鉴定所构建的重组质粒.全骨髓差速贴擘法分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增传代.通过形态学观察及表面标记物进行细胞鉴定.通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达.将制备好的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞存体外缺氧环境下分别培养6,12,24h,另设相同缺氧干预下的空白骨髓间充质干细胞组,以转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组作为对照,采用RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达量.结果:酶切鉴定法、PCR鉴定法、DNA序列测定皆证实pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功.使用pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜检测提示hVEGF121/EGFP蛋白在骨髓间充质干细胞中存在表达.在体外模拟心肌缺氧的环境下分别培养6,12,24h后,RT-PCR检测示转染重组质粒的骨髓间充质干细胞组各时间段缺氧后的血管内皮牛长因子mRNA表达量均高于对照组(P<0.01),且不同时间段间差异无显著性意义(P0.05);空白骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达量随缺氧时程的延长而增加.结论:[1]成功构建携带人VEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,并在骨髓间充质干细胞中获得表达.[2]证实表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在24h以内的不同时长缺氧下,维持较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的血管内皮生长因子表达.     

生长因子可促进自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

背景：生长因子是干细胞强有力的动员剂,可以增加注射细胞的黏附力和增殖力,诱导干细胞向梗死区迁移、增殖分化,参与心肌修复。 目的：观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的联合应用在骨髓间充质干细胞自体移植治疗心肌梗死中的作用。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,原代培养后采用红光荧光染料 CM-Dil 标记。结扎冠脉前降支制作兔急性心肌梗死模型,然后随机均分为对照组、骨髓间充质干细胞组、肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子组和肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组。于心肌梗死区心肌内分4点共注射不同干预试剂。Masson三色法染色检测存活心肌;免疫荧光检测骨髓间充质干细胞分化;心脏超声评价心功能。 结果与结论：建模后4周,肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组 CM-Dil/cTNT＋细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组,其存活心肌最多,左室射血分数改善最明显,左室舒张末径最小。肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合应用促进自体移植的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,增加存活心肌数量,改善心功能,抑制心室重构,可能成为心肌梗死后细胞治疗的有效方法。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景:间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的:观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法:骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论:通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高(P < 0.05)。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡及血管内皮生长因子的表达

背景:目前在临床多采用自体骨髓干细胞及自体外周血干细胞治疗糖尿病足溃疡,少见利用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病足溃疡的基础研究.目的:观察局部移植异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡的效果及血管内皮生长因子的全身及局部表达情况.方法:取雄性Wistar大鼠90只,随机数字表法分为3组:对照组(正常足部溃疡)、干细胞治疗组、糖尿病对照组.干细胞治疗组、糖尿病对照组建立2型糖尿病足溃疡模型,造模后分别注射同种异体骨髓间充质干细胞、干细胞培养基DMEM.造模后第1,4,8天观察各组大鼠溃疡面积、细胞核染色示踪及病理学检查,ELISA法测外周血血管内皮生长因子浓度、Western-blotting法测局部血管内皮生长因子浓度.结果与结论:与糖尿病对照组比较,干细胞治疗组溃疡愈合速度迅速,但仍较对照组愈合缓慢,外周血中血管内皮生长因子表达增高,也未达到正常水平.异体干骨髓间充质干细胞治疗前期(1～4 d)能明显提高局部血管内皮生长因子浓度,但在后期(8 d)局部浓度提高不足.干细胞治疗组愈合缓慢,表皮覆盖不完全,但较糖尿病对照组愈合明显提前,表皮覆盖较明显;细胞核染色示移植后干细胞均聚集于溃疡区周围.提示异体移植骨髓间充质干细胞可促进大鼠糖尿病足溃疡的愈合,其促进愈合的可能机制为其上调了血管内皮生长因子在全身尤其局部的表达.     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力

背景:基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少.目的:观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响.方法:贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞.用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率.骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组.在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果与结论:重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%.缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05).缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05).提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关.