恶性疟原虫多价重组疫苗的研制及其免疫活性的初步鉴定

为了探讨含Ｔ、Ｂ淋巴细胞双重激活表位的重组复合症疾抗原的免疫原性和保护作用，作者设计合成了编码恶性疟原虫红内期３个保护性抗原位点和２个外源性Ｔ细胞激活位点的复合基因ＨＧＦＣ，并构建了多连体复合基因ＨＧＦＣＡＣ。两种复合基因分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组，并在大肠杆菌中表达出含外源蛋白和β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白（分子量分别为６５０００和７７０００），表达量为３５％。表达产物可与小鼠及兔抗恶性疟原虫抗体发生特异性免疫反应。用纯化的融合蛋白免疫家兔制备的免疫血清可特异地识别恶性疟原虫抗原，并对疟原虫体外生长有显著抑制作用。抑制程度与免疫血清浓度及作用时间呈正相关，在２０％浓度下作用７２小时，抑制率可达８２％，并引起疟原虫发育不良和死亡。研究结果说明，制备的恶性疟原虫重组复合抗原具有免疫原性和一定的免疫保护作用，可作为恶性疟疫苗候选物。     

亚性疟原虫多价重组疫苗的研制及其免疫活性的初步鉴定

为了探讨Ｔ、Ｂ淋巴细胞双重激活表位的重组复合症疾抗原的免疫原性和保护作用，作者设计合成了编码亚性疟原虫红内期３个保护性抗原位点和２个外源性Ｔ细胞激活位点的复合基因ＨＧＦＣ，并构建了多连体复合基因ＨＧＦＣＡＣ。两种复合基因分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组，并在大肠杆菌中表现出含外源蛋白和β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融俣蛋白，表达量为３５％。     

恶性疟的两种重组复合抗原的纯化与鉴定

用我们构建的高效表达恶性疟原虫复合抗原融合蛋白的工程菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９进行发酵培养，收集菌体经超声波破菌、硫酸铵分级沉淀、分子筛层析、离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８２．０％。纯化后的融合蛋白保持β－半乳糖苷酶的活性。用等电聚焦技术测定纯化蛋白等电点分别为８．４０和８．２５．用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体及疟区病人血清发生特异性免疫反应。重组蛋白加弗氏佐剂免疫家兔制备的抗血清可与４种工程菌表达产物发生特异免疫反应，并可识别恶性疟原虫海南株和云南株红内期抗原。说明纯化的重组融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复会抗原。     

疟疾基因工程疫苗的研究Ⅱ．恶性疟保护性抗原复合基因的串接与克隆

将人工合成的恶性疟原虫４５肽抗原基因ＨＰＦＡ和７５肽抗原基因ＨＧＦＣ分别从克隆载体上切下，经过一系列的串接和克隆，筛选出含有ＨＧＦＣ－ＨＰＦＡ－ＨＧＦＣ三连体基因（ＨＧＦＣＡＣ）的重组克隆，经酶切鉴定和ＤＮＡ序列分析证实基因序列与设计一致。该三连体基因含有起始和终止密码，编码一个１９３肽的复合抗原。多连体基因串接与克隆的成功，在基因水平上实现了复合抗原的多聚，从而为进一步研究疟疾多价疫苗的结构和功能提供了条件。     

恶性疟原虫多表位重组疫苗在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 在体外表达和纯化目的的蛋白,为下一步抗攻击试验提供安全有效的产品。方法 将化学合成的恶生疟原虫保护性抗原复合基因（ＨＧＦＳＰ）与表达载体ｐＲＳＥＴ重组,在大肠杆菌ＧＩ２１进行表达;工程菌经超声破菌、离心、离子交换层析、疏水层析、分子支析等步骤纯化。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物以非融合、可溶性的形式表达,相对分子质量为２３ｋＤａ,占总菌体蛋白的２３．６５％,纯度可达９５％以上。Ｗｅｓｔｅ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

问号赖型钩体内鞭毛基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌的表达

为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，利用聚合酶链反应扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经ＳａｌⅠ、ＣｌａⅠ双酶切消化后定向克隆于ｐＴ７－７表达载体上。重组质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示此产物相对分子量为３４ｋｄ，产量占细菌总蛋白的１１．８％。用插入片段为探针，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交提示可能有两个相关的基因存在于钩体的基因组内。Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交证实该表达蛋白可与内鞭毛抗血清在３４ｋｄ处出现印迹，与钩体内鞭毛同类蛋白带位置一致，本实验克隆了钩体内鞭毛Ｂ类基因并表达了相应抗原。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析

目的：通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的表达,为ｂＦＧＦ进一步研究提供材料来源,方法：用多聚酶链反应（ＰＣＲ）及ＤＮＡ重组技术将ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－５Ｚ载体并测序,然后克隆到表达载体ｐＸＨ上。结果：转化重组质粒ｐＬＸ１的大肠杆菌经４２℃温控诱导４￣５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示融合蛋白的分子量约３５０００,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体     

BPI23—Fcγ1重组蛋白核表达载体的构建、表达和生物学活性的测定

目的：构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α,诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＢＰＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白;测定ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果：⑴ＲＴ－ＰＣＲ获得预期的扩增产物－ＢＰＩ６００ｂｐ和Ｆｃγ１７００ｂｐ基因片段;⑵成功构建ｐＵＣ１８－ＢＰＩ１８０、ｐＵＣ１８－ＢＰＩ４２０和ｐＵＣ１８－Ｆｃγ１７００重组克隆载体,ＤＮＡ测序结果与文献报道一致;⑶成功构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符;     

日本血吸虫重组抗原的诱导表达及其免疫学活性鉴定

为了筛选和发现日本血吸虫新的疫苗候选抗原分子我们构建了日本血吸虫抗原ＰＳｊ＾５１４与表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ重组体，表达克隆ｐＧＳｊ２４。对工程菌的诱导表达及表达产物分析证实，特异性表达产物是分子量约为２２ｋＤａ的两条十分接近的蛋白带。该蛋白可溶性蛋白，表达方式为分离表达，可被日本血吸虫免疫兔血清，感染兔血清及病人血清特异地识别。     

整合蛋白α_5β_1和纤连蛋白与肝细胞癌生物学行为的关系

探讨整合蛋白α５β１和纤连蛋白（ＦＮ）表达与肝细胞癌（ＨＣＣ）生物学行为间的关系。应用免疫组化及图象分析技术对４０例ＨＣＣ组织作整合蛋白α５β１和ＦＮ定位及定量分析。结果：高分化ＨＣＣ组织整合蛋白α５β１和ＦＮ表达与正常及癌旁组织相近，而中、低分化ＨＣＣ中两者均明显减弱或消失；肿瘤浸润包膜处两种蛋白表达减少，但血管内癌栓外侧缘癌细胞整合蛋白α５β１和ＦＮ表达较强，并与相应血管内皮的强表达相映。结论：整合蛋白α５β１和ＦＮ表达的变化可能与ＨＣＣ分化、浸润及转移关系密切。     

人G—CSF重组表达系统稳定性的实验研究

将构建好的人Ｇ－ＣＳＦ表达工程菌，连续培养１４０代，其抗生素抗性无改变，重组质粒ＤＮＡ酶切鉴定及目的的蛋白表达率与原始菌基本一致。     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。     

人aFGF cDNA的次级克隆及其重组产物的纯化

目的：为使ａＦＧＦ表达产量提高，以便于纯化，将载有人酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）全编码区ｃＤＮＡ的ＰＫＫ２２３－３质粒自ＤＨ５α细菌转入ＪＭ１０５细菌。方法：采用超声法和溶菌酶破碎法裂解扩增的ＪＭ１０５细菌，通过ＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ亲和层析法提纯表达的重组产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的结果表明，纯化重组产物的分子量约为１８０００。结论：人重组酸性成纤维生长因子在大肠杆菌中得到表达及鉴定     

钩体017株基因库pDJH_2与L．alstoni重组DNA探针同源性及pDJH_2在大肠杆菌中表达产物的分析

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ＿２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。结果显示：该重组ＤＮＡ探针与ｐＤＪＨ＿２１．９ｋｂ插入片段同源；使用ＩＰＴＧ诱导重组质粒ｐＤＪＨ＿２后，其在大肠杆菌中表达了６８ｋｄ产物。经蛋白酶Ｋ消化、免疫印迹及斑点一酶联免疫吸附试验，提示此６８ｋｂ产物是蛋内质抗原；用该６８ｋｂ蛋白质抗原主动免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，可抵抗强毒力赖型钩体０１７株的攻击，表现出对小鼠的免疫保护性，从而为赖型钩体０１７株基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。此赖型０１７株钩体重组ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠杆茵中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。     

恶性疟原虫基因组文库的构建及未知抗原cDNA片段的筛选

恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ经Ｘａｕ３ＡＩ部分酶切，取１４－２３ｋｂ片段连接入ＧＥＭ－１１λ噬菌体置换型载体构建基因组库。所得重组体数目为７．３×１０＾４ｐｆｕ，近达构建完整恶性疟原虫基因组库理论值的１０倍。随机挑取该库１０个噬菌斑，抽提λＤＮＡ，用Ｘｈｏ１酶切，得到１４－２３ｋｂ的插入片段和载体双臂，符合建库要求，以抗体筛选恶性疟原虫ｃＤＮＡ表达库所获得的未知抗原ＣＤＮＡ片段为探