赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定

目的 确定我国15群15株问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株和2群2株双曲钩体国际标准株携带LipL41基因情况，构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫原性。方法 常规酚—氯仿法提取上述17株钩体基因组DNA，高保真PCR扩增全长LipL41基因片段，T—A克隆后测序分型。构建LipL41基因原核表达系统，SDS-PAGE检测重组目的蛋白(rLipL41)表达情况。分别用钩体属特异性TP/patoe Ⅰ抗原、rLipL41兔抗血清的Western blot鉴定其免疫反应性和抗原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)、钩体黏附J774A．1细胞模型检测兔抗rLipL41血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用。结果 15株问号钩体均有LipL41基因，并可分为LipL41／1和LipL41／2两种基因型，2株双曲钩体则否。11个LipL41／1基因和4个LipL41／2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88．61％—88．67％和93．24％—97．18％。所构建的原核表达系统rLipL41／1和rLipL41／2的表达量分别占钩体总蛋白的30％和40％。rLipL41／1和rLipL41／2均能与TP/patoe Ⅰ抗血清发生结合反应，免疫家兔能产生抗体。rLipL41／1和rLipL41／2兔抗血清对上述15株问号钩体MAT效价为1：8，1：128、1：16～1：2．S6稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附。结论 我国主要的15群问号钩体代表株均有LipL41／1或LipL41／2基因。所构建原核表达系统能高效表达rLipL41／1和rLipL41／2。rLipL41／1和rLipL41／2是具有良好抗原性和免疫反应性、广泛存在于不同血清群问号钩体表面的蛋白抗原。     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响

目的:构建表达致病性赖型 017株钩端螺旋体OmpL1外膜蛋白的真核-原核穿梭表达载体,并在原核细胞中表达出目的蛋白。方法:用PCR方法从 017株钩体基因组中钓出OmpL1蛋白基因,酶切纯化后与质粒pBK-CMV连接,通过电泳、限制性内切酶分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后提取总蛋白以SDS-PAGE检测表达情况,同时监测目的蛋白表达前后各时段宿主菌OD600值的变化。结果:筛选出 5株带重组质粒菌,其中有 4株能在大肠杆菌中表达 37kD的特异蛋白,而且随着该外源蛋白的表达,宿主菌生长各时段的OD600值下降。结论:成功地构建了钩体OmpL1蛋白的穿梭表达质粒,并在大肠杆菌中表达出OmpL1融合蛋白,该异源蛋白的表达导致宿主菌的活力降低。本工作为OmpL1蛋白用于钩体病诊断、疫苗研制和致病机制的研究奠定了基础.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出外膜蛋白新基因ompL17，与打靶载体p2NIL重组，并插入氨苄抗生素抗性基因伽”使外膜蛋白新基因ompL17失活，构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株，通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dot blot和酶切分析，证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体，并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除，并构建钩体017株突变株，为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。     

赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的：克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。 方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因，双酶切构建重组质粒，转化E.coliJM109，诱导表达HlyX；将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，Western blotting鉴定其免疫原性；将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞，通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。 结果:扩增出1 179 bp的目的基因HlyX，重组质粒经双酶切、PCR鉴定，测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64 kD，主要以包涵体的形式表达，经免疫动物得到多克隆抗体，ELISA检测效价达1∶〖KG-*2〗64 000； Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组（P<0.01）。 结论:HlyX能在大肠杆菌中表达，表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。     

问号状赖型钩端螺旋体LAg42膜蛋白基因的克隆及真核表达研究

目的:构建赖型钩端螺旋体lag42基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞,为进一步研究奠定基础。方法:分别以问号状赖型钩体017株,56601株及双曲钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建lag42基因与质粒pcDNA3.1A 的重组真核表达质粒,克隆筛选并测序;通过脂质体介导将重组质粒转染入COS7细胞,用RT-PCR检测转染结果。结果:不同毒力赖型钩体均能扩增出约1100 bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pcDNA3.1A -lag42构建成功;经RT-PCR检测证实重组质粒转染成功。结论:赖型钩体具有编码LAg42膜蛋白的基因,构建完成真核表达载体pcD-NA3.1A -lag42,并成功转染COS7细胞。     

问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答

目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型.方法 IPTG诱导目的 重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32.采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况.采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位.建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平.结果 黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群.rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1∶80～1∶320的交叉凝集反应.LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子.156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%～92.9%和90.4%～92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%～98.1%.结论 LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原.自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体.rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原.     

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的　探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法　常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果　上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论　所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。所     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究

目的:探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因及其表达产物23 kDa蛋白的特点。方法:用6种内切酶对pDL121行酶谱分析,用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交,用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,Western blot鉴定其免疫原性。结果:pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017,serovar hebdomadis strain56610,serovar pomona strain 56608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc I,serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。23 kDa兔抗血清可识别pDL121体外表达的23 kDa蛋白带和赖型钩体017株超声抗原成份;其抗体滴度为1/12800;用pDL121细菌裂解液主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论:pDL121外源基因可能是赖型钩体的一个新基因;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体;23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

Effect of Leptospira interrogans outer membrane proteins LipL32 on HUVEC

Leptospira cause disease through a toxin-mediated process by inducing vascular injury, particularly a small-vessel vasculitis. Breakdown of vessel endothelial cell integrity may increase vessel permeability which is correlated with the changes of tight junction and/or apoptosis in vessel endothelial cells. The specific toxin responsible remains unidentified. In this study, we amplified outer membrane protein LipL32 from the genome of Leptospira interrogans serovar Lai, and it was subcloned in pET32a(+) vector to express thioredoxin(Trx)–LipL32 fusion protein in Escherichia coli BL21(DE3). The protein was expressed and purified, and Trx–LipL32 was administered to culture with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) to elucidate the role of leptospiral outer membrane proteins in vessel endothelial cell. The purified recombinant protein was capable to increase the permeability of HUVECs. And the protein was able to decrease the expression of ZO-1 and induce F-actin in HUVECs display thickening and clustering. Moreover, apoptosis of HUVEC was significantly accelerated. But the fusion partner had no effect in these regards. It is possible that LipL32 is involved in the vessel lesions.     

hGR小基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的：构建用于体内剪接分析的人糖皮质激素受体（hGR）小基因真核表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,设计特定的引物进行PCR扩增获得3.892 kb长的hGR小基因片段,并将其连入pMD18-TSimple载体中,限制性内切酶酶切鉴定后,再亚克隆到PcDNA3载体中,获得hGR小基因真核表达质粒PcDNA3-hGR并测序验证。Lipofectamine法转染PcDNA3-hGR至HeLa细胞,RT-PCR检测hGR小基因剪接异构体hGRα and hGRβ mRNA的表达。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实克隆片段序列与GenBank目标序列一致；PcDNA3-hGR在HeLa细胞内成功表达剪接异构体hGRα和hGRβ。结论:hGR小基因真核表达载体构建成功，为进一步研究糖皮质激素受体基因外显子9的选择性剪接提供了细胞分子模型。     

小鼠α烯醇化酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠α烯醇化酶（En01）基因的真核表达载体。方法以健康小鼠肾脏组织细胞的eDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增Enol基因编码区的全部序列,克隆至真核细胞表达载体pCDNA3．1^＋中,测序鉴定目的基因用阳离子脂质体转染的方法转染中国仓鼠卵巢CHO细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为1304bp,以此构建重组质粒pCDNA3．1^＋-Enol,测序结果与Gen．bank中的鼠源Enol基因eDNA序列一致。转染中国仓鼠卵巢细胞后可检测到Enol蛋白的表达。结论构建的真核表达载体pCDNA3．1^＋-Enol可在真核细胞内正确表达,这为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1的构建及鉴定

目的构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1,使外源性VEGF120基因可以在真核细胞中表达。方法利用缺氧后大鼠脑组织,提取总RNA,采用RT-PCR技术,利用已知引物合成cDNA,将VEGF120基因扩增后插入真核细胞表达载体pCDNA 3.1。重组质粒热转化至感受态E.ColiJM109细胞中,获得重组菌株。提取质粒,进行酶切鉴定及插入基因进行测序。结果限制性内切酶酶鉴定及测序证实已将VEGF120cDNA成功插入真核细胞表达载体。结论成功构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA3.1,本实验研究为外源性VEGF基因导入真核细胞提供一种途径。     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。