问号钩端螺旋体在体外诱导细胞凋亡及相关信号通路的研究

目的 了解问号钩端螺旋体诱导不同宿主细胞凋亡的作用及相关胞内信号传导通路.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖型赖株小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1、人脐静脉内皮细胞EVC304和人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549感染模型.采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况.分别采用荧光比色法和Western blot检测感染的J774A.1细胞caspase-3,-8,-9活性和凋亡相关蛋白FADD(Fas-associated death domain)表达水平.结果 问号钩体赖株感染1～6 h后,36.70%～63.70%的J774A.1细胞可H{现明显的早期凋亡,感染12 h时转变为晚期凋亡或坏死为主(53.68%).78.52%问号钩体赖株感染的A549细胞仪出现晚期凋亡或坏死.问号钩体赖株感染的EVC304细胞无细胞凋亡或坏死现象.感染的J774A.1细胞caspase-3和-8最大活性分别为(1453.41±36.07)和(1402.15±59.09)Fu,是未感染细胞的16.38和29.99倍.感染的J774A.1细胞caspase-9虽略有升高为(89.42±5.08)Fu,但明显低于caspase-3和-8(P<0.001).随着感染时间的延长,感染的J774A.1细胞FADD蛋白表达量逐步增加.结论 问号钩体诱导宿主细胞凋亡的效应町因细胞种类不同而有明显差异,FADD→caspase-8→caspase-3是介导问号钩体感染J774A.1细胞凋亡的主要信号通路.     

问号钩端螺旋体侵入单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性研究

目的 探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)侵入人或鼠单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性.方法 采用透射电镜观察问号钩体黄疸出血群赖型赖株侵入小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和佛波酯(PMA)激活的人单核细胞THP-1后吞噬泡形成情况.采用免疫荧光联合激光共聚焦显微镜及荧光分光光度仪等方法,观察细胞内吞抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)、氧化酚砷(PAO)阻断及内吞相关网格蛋白抗体封闭前后,J774A.1细胞和PMA激活的THP-1细胞内问号钩体赖株数量的变化.结果 J774A.1细胞内问号钩体存在于吞噬泡内,THP-1细胞内问号钩体无吞噬泡膜包绕.MDC和PAO能以剂量依赖方式抑制J774A.1和THP-1细胞内吞问号钩体,其中10 μmol/L以上MDC和1 μmol/L以上PAO阻断的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量明显少于未阻断细胞(P＜0.05).网格蛋白抗体封闭后,J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量也明显减少(P＜0.05).结论 问号钩体以网格蛋白依赖性内吞途径侵入人或鼠单核-巨噬细胞.人或鼠单核-巨噬细胞内问号钩体吞噬泡形成有明显差异,这可能是人或鼠感染问号钩体后发病情况不同的原因之一.     

问号钩端螺旋体经线粒体相关信号通路诱导巨噬细胞凋亡的研究

目的 确定线粒体相关信号转导途径在问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导小鼠单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖株诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1凋亡模型.采用透射电镜观察感染细胞线粒体病变情况,JC-1染色法检测感染细胞线粒体膜电位变化,荧光探针DCFH-DA检测感染细胞内活性氧(ROS)水平.采用试剂盒检测感染细胞caspase-8和caspage-9活性变化.流式细胞术检测感染细胞凋亡情况以及cagpage阻断剂阻断凋亡的效果.采用Western blot检测线粒体内和胞质中的细胞色素c(cytc)以及凋亡诱导因子(Air)、核酸内切酶G(EndoG)和Smac水平.应用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG从细胞质至核内的转位.结果 问号钩体赖株可诱导J774A.1细胞凋亡.感染细胞的线粒体有明显病变,线粒体膜电位降低且胞内活性氧水平升高.感染细胞caspage-8活化,caspase-9则否,但caspase阻断剂不能完全阻断细胞凋亡.感染细胞AIF和EndoG从线粒体释放至胞质并转位至细胞核内.未检测到感染细胞胞质内CytC水平升高及Smac的释放.结论 线粒体可通过非caspase途径的AIF和EndoG参与问号钩体诱导单核一巨噬细胞凋亡的过程.     

问号钩端螺旋体经线粒体相关信号通路诱导巨噬细胞凋亡的研究

目的 确定线粒体相关信号转导途径在问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导小鼠单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖株诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1凋亡模型.采用透射电镜观察感染细胞线粒体病变情况,JC-1染色法检测感染细胞线粒体膜电位变化,荧光探针DCFH-DA检测感染细胞内活性氧(ROS)水平.采用试剂盒检测感染细胞caspase-8和caspage-9活性变化.流式细胞术检测感染细胞凋亡情况以及cagpage阻断剂阻断凋亡的效果.采用Western blot检测线粒体内和胞质中的细胞色素c(cytc)以及凋亡诱导因子(Air)、核酸内切酶G(EndoG)和Smac水平.应用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG从细胞质至核内的转位.结果 问号钩体赖株可诱导J774A.1细胞凋亡.感染细胞的线粒体有明显病变,线粒体膜电位降低且胞内活性氧水平升高.感染细胞caspage-8活化,caspase-9则否,但caspase阻断剂不能完全阻断细胞凋亡.感染细胞AIF和EndoG从线粒体释放至胞质并转位至细胞核内.未检测到感染细胞胞质内CytC水平升高及Smac的释放.结论 线粒体可通过非caspase途径的AIF和EndoG参与问号钩体诱导单核一巨噬细胞凋亡的过程.     

感染细胞内问号钩端螺旋体吞噬泡形成及其与溶酶体的融合

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染宿主细胞后吞噬泡形成、吞噬泡与溶酶体融合及感染细胞超微结构改变。方法用问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核巨噬样细胞j774A．1和猴肾成纤维细胞Cos-7。采用透射电镜观察J774A．1细胞和Cos-7细胞胞内钩体吞噬泡的形成及感染细胞超微结构的改变。采用免疫双荧光染色法和激光共聚焦显微镜，观察含钩体吞噬泡与溶酶体融合情况。结果问号钩体56601株感染J774A．1细胞30min、感染Cos-7细胞15min即可在胞浆中发现膜包绕的含钩体吞噬泡，吞噬泡内钩体均保持原有生理弯曲。56601株问号钩体感染Cos-7细胞2h后，钩体吞噬泡膜开始消失，但未发现j774A．1细胞内钩体吞噬泡膜消失的现象。J774A．1细胞内钩体吞噬泡与溶酶体发生共区域化，表明吞噬泡与溶酶体发生融合。J774A．1细胞感染钩体后出现染色质浓缩形成的凋亡小体样结构、细胞空泡变性、线粒体肿胀等超微结构病变，但Cos-7细胞感染钩体后其超微结构基本正常。结论问号钩体感染J774A．1细胞和Cos-7细胞后可迅速形成吞噬泡并可能与钩体Ⅲ型分泌系统产物有关。J774A．1细胞内钩体吞噬泡可与溶酶体发生融合。不同细胞的钩体吞噬泡膜消失及超微结构改变有明显差异。     

问号钩端螺旋体内化过程中细胞内游离Ca2+水平变化及细胞凋亡

目的建立观察问号钩端螺旋体(简称钩体)黏附的双荧光染色法,探讨不同毒力钩体对细胞内游离Ca2+水平及细胞凋亡的影响.方法以问号钩体黄疸出血群赖型56601株和双曲钩体三堡垄群patoc型PatocⅠ株抗血清为一抗、羊抗兔IgG荧光素F(ab)2和罗丹明F(ab)2片段为二抗的双荧光染色法,分别检测56601株和PatocⅠ株钩体对Vero、J774A.1细胞的黏附作用.采用fluo-3/AM胞内Ca2+特异荧光标记激光共聚焦技术,检测问号钩体56601株和波摩那群波摩那型56608株、双曲钩体PatocⅠ株作用的J774A.1细胞胞内游离Ca2+水平的变化.采用FITC-annexinⅤ/PI荧光标记流式细胞术,检测紫外线灭活前后的56601株钩体诱导Vero和J774A.1细胞凋亡的情况.结果所建立的双荧光染色法能清晰地观察到强毒力的56601株钩体对Vero和J774A.1细胞的黏附,无毒力的PatocⅠ株钩体则否.正常J774A.1细胞胞内游离Ca2+基础值为(105.0±7.0)%,PatocⅠ株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于(102.2±5.2)%.56601株钩体感染J774A.1细胞胞内游离Ca2+浓度迅速增高,呈现为双峰型曲线,其荧光强度变化百分数分别为(747.5±35.7)%和(804.6±40.8)%.56608株钩体感染J774A.1细胞胞内游离Ca2+浓度呈现为缓慢的单一坡型升高,其最大荧光强度变化百分数为(402.4±23.6)%,明显小于56601株钩体,差异有统计学意义(P<0.01).紫外线灭活前后56601株钩体作用Vero细胞的凋亡率分别为84.5%和78.2%,J774A.1细胞凋亡率分别为34.5%和30.9%.结论所建立的双荧光染色法可用于观察钩体的黏附.细胞胞内游离Ca2+水平与所感染的钩体菌株毒力成正相关.有毒力的钩体接触细胞时即可诱导凋亡发生,启动细胞凋亡信号通路的配体分子可能位于钩体表面.     

钩端螺旋体溶血素Sph2表达模式及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡活性

目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法 采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2(rSph2)的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2.采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性.采用流式细胞术检测rSph2诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和肝细胞株IAR20凋亡的活性,实时荧光定量PCR检测赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞前后sph2基因mRNA水平变化.结果 与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100%.所构建的原核表达系统能高效表达rSph2.rSph2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞.10 μg/ml rSph2可诱导J774A.1和IAR20细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96%和32.92%.赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞后0.5～2 h内sph2基因mRNA水平显著升高,2 h后mRNA水平迅速下降.结论 钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达.rSph2有溶解绵羊红细胞及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡的活性,因而Sph2是钩体致病过程中重要的毒力因子.     

钩端螺旋体脂多糖诱导J774A.1细胞凋亡及相关信号通路调控作用的研究

目的 了解问号钩端螺旋体脂多糖(L-LPS)体外诱导小鼠单核-巨噬样细胞株(J774A.1)凋亡及Toll样受体(TLR)和相关信号通路调控细胞凋亡的作用.方法 酚水法从问号钩体黄疸出血群赖型赖株中提取L-LPS.流式细胞术测定L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡及FasL中和抗体阻断细胞凋亡的作用.实时荧光定量RT-PCR(qPCR)及流式细胞术检测L-LPS作用前后J774A.1细胞Fas/FasLmRNAs和蛋白表达水平变化.TLR2或TLR4抗体封闭试验、信号通路阻断试验及流式细胞术,检测TLR2、TLR4及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和胞外信号调节激酶(ERK)通路对L-LPS诱导细胞凋亡的调控作用.结果 100 ng/ml L-LPS作用J774A.1细胞4、12和24 h的凋亡率分别为56.50%、69.28%和24.35%,FasL中和抗体封闭后,细胞凋亡率分别下降至11.21%、21.58%和12.70%(P＜0.05).L-LPS作用4、12和24 h的J774A.1细胞FasL和Fas mRNAs水平分别为正常细胞的1.34、2.12、2.10及2.45、3.87、3.12倍(P＜0.05),FasL和Fas蛋白表达率分别从L-LPS作用前的4.82%和15.32%上调至18.61%、60.13%、42.75%(P＜0.05)和76.34%、85.70%和77.92%(P＜0.05).TLR2抗体封闭后L-LPS诱导J774A.1细胞的凋亡率(11.54%)明显低于未封闭细胞(66.56%,P＜0.05),但TLR4抗体封闭细胞的凋亡率仍高达55.27%(P＞0.05).p38MAPK与JNK通路阻断后L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡率(20.54%和47.98%)明显低于未阻断细胞(62.17%,P＜0.05),ERK通路阻断后细胞凋亡率仍高达61.72%(P＞0.05).结论 L-LPS经TLR2识别后通过p38MAPK和JNK通路上调J774A.1细胞Fas和FasL表达,从而参与L-LPS诱导细胞凋亡过程.     

问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化

目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性最强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.     

不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化

目的 探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异。方法 实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)和小鼠单核巨噬样细胞(J774A．1)细胞株。采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法，观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型56601、弱毒株波摩那群波摩那型56608黏附细胞及内化能力及其差异，采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型Patoc I株作为对照.结果 问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株和波摩那群波摩那型56608株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A．1细胞。钩体56601株和56608株对J774A．1的黏附率分别为49％和46．9％，对Vero细胞黏附率分别为24．2％和22．9％。钩体56601株和56608株可侵入上述2株细胞，在胞质内形成典型的吞噬泡。钩体56601株还可侵入宿主细胞核内，56608株则否。双曲钩端螺旋体二宝垄群patoc型Patoc I株不能黏附和侵入细胞。结论 两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞，并以内化方式侵入细胞。细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力。问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关，而与其侵入胞核的能力密切相关。     

Caspase-11非经典炎症小体对问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞炎性细胞因子分泌水平的影响

目的:了解caspase-11非经典炎症小体对问号钩端螺旋体(钩体)诱导J774A.1细胞分泌炎性细胞因子的影响。方法:采用钩体56601株感染小鼠单核-巨噬细胞株(J774A.1)建立细胞模型,应用real-time RT-PCR检测J774A.1细胞caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平,采用ELISA定量检测J774A.1细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平。结果:Real-time RT-PCR检测结果显示,钩体感染J774A.1细胞1、2、4、8、12和24 h后,caspase-11 mRNA水平分别为未感染细胞的5.12、14.21、8.94、14.06、18.58和0.93倍,caspase-11阻断后分别下降至0.10、0.07、0.10、0.09、0.07和0.45倍( P<0.05);钩体感染后,IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平均显著上调,caspase-11阻断后IL-1β mRNA水平分别下降至0.05、0.03、0.02、0.05、0.06和0.02倍( P<0.05);IL-1α mRNA分别下降至0.14、0.07、0.15、0.10、0.03和0.06倍( P<0.05);IL-18 mRNA分别下降至0.08、0.10、0.16、0.18、0.10和0.07倍( P<0.05)。ELISA检测结果显示,钩体感染J774A.1细胞后细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平均显著上调,caspase-11阻断后caspase-11分别下降至43.07、41.64、51.96、86.56、105.36和129.95 pg/ml( P<0.05);IL-1β分别下降至15.01、14.19、68.02、31.20、173.13和104.98 pg/ml( P<0.05);IL-1α分别下降至12.14、15.40、38.01、21.97、24.48和27.09 pg/ml( P<0.05);IL-18分别下降至96.27、102.21、85.34、116.28、155.36和114.03 pg/ml( P<0.05)。 结论:Caspase-11非经典炎症小体参与介导问号钩体诱导小鼠单核-巨噬细胞IL-1β、IL-1α和IL-18的分泌。     

Francisella tularensis LVS initially activates but subsequently down-regulates intracellular signaling and cytokine secretion in mouse monocytic and human peripheral blood mononuclear cells

Monocytic cells constitute an important defense mechanism against invading pathogens by recognizing conserved pathogens components. The recognition leads to activation of intracellular pathways involving nuclear factor kappa B (NF-kappaB) and mitogen-activated protein kinases (MAPK), such as the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), and p38. We show that in vitro infection with Francisella tularensis results in activation of NF-kappaB, phosphorylation of p38 and c-Jun, and secretion of TNF-alpha in adherent mouse peritoneal cells, in the mouse macrophage-like cell line J774A.1, in the human macrophage cell line THP-1, and in human peripheral blood monocytic cells. This occurred after infection with the human live vaccine strain, F. tularensis LVS or a mutant strain denoted deltaiglC, which lacks expression of a 23-kDa protein, or after addition of killed F. tularensis LVS. Addition of purified F. tularensis LPS resulted in no discernible effects on the cells. When the effects were followed up to 5 h, activation persisted in cultures with killed bacteria or infected with the deltaiglC strain. In contrast, the signal transduction activation and secretion of TNF-alpha were down-regulated within the 5h period in mouse peritoneal cells, J774 cells or human peripheral blood mononuclear cells infected with F. tularensis LVS. Together, the results suggest that infection with live F. tularensis LVS bacteria leads to a rapid induction of a proinflammatory response in mouse and human cells but after internalization of bacteria, this response is completely or partly down-regulated in most cell types. This down-regulation does not occur when cells are infected with the mutant deltaiglC.     

刚地弓形虫培养上清对THP-1增殖的影响及可能机制

 利用弓形虫速殖子细胞内寄生的特性和对宿主细胞生物学行为的影响,提取弓形虫体外细胞共培养上清,并研究上清对人急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖及细胞周期的影响。方法 取对数生长期的THP-1细胞（浓度为5×105）分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入含10%胎牛血清RPMI-1640,试验组加入相同体积不同数量(2×107mL-1、 4×107mL-1、 8×107 mL-1 )弓形虫速殖子培养上清孵育不同时间后, MTT法检测THP-1细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞周期改变;以Western印迹方法分析上清作用48h后细胞核转录因子NF-κB/p65与周期蛋白cyclinD1表达或活性的变化。结果 MTT法检测结果显示弓形虫培养上清抑制THP-1细胞株增殖,且呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测显示处理组细胞周期在G0/G1期产生阻滞; Western印迹方法分析THP-1细胞株的NF-κB/p65、cyclin D1 蛋白表达量下降,结论 刚地弓形虫培养上清能够抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞株增殖并可通过细胞株的NF-κB信号途径来下调cyclin D1蛋白表达引起人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞株G0/G1期阻滞。