叶酸对同型半胱氨酸所致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的:通过培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC),研究不同浓度的同型半胱氨酸(Hcy)对内皮细胞损伤的影响,并观察叶酸的干预是否能够削弱Hcy对HUVEC的细胞毒作用。方法:将培养的HUVEC细胞分成8组,将其与不同浓度的Hcy(100,200,500,1000,2000μmol/L)和叶酸(100μmol/L)共同培养20h,分别利用MTT、苏木精-伊红染色和流式细胞仪技术观察HUVEC细胞的生长及凋亡情况。结果:HUVEC与不同浓度的Hcy培养20h后,细胞活力A值呈现剂量依赖性的降低,超过500μmol/L的Hcy对HUVEC已经形成了显著的抑制和毒性效应,滞留于G1期的细胞比例增加,由于对照组的56.3%上升至60.0%(Hcy100μmol/L),63.1%(Hcy200μmol/L),64.4%(Hcy1000μmol/L),73.9%(Hcy2000μmol/L);100μmol/L的叶酸能够在一定程度上抑制Hcy诱导凋亡的作用。结论:高浓度的Hcy具有内皮细胞毒作用,可以抑制细胞的生长并促进其凋亡,而叶酸则具有保护性。     

盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的干预

目的：观察盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的影响。 方法：实验于2005-02／08在西京医院神经内科实验室完成。人脐静脉内皮株细胞培养，取第4—7代指数生长期细胞，接种到96孔板，24h细胞贴壁后换液，加入药物处理，随机分为正常对照组、同型半胱氨酸组及盐酸氟桂利嗪组3组，正常对照组，仅予空白RPMI-1640培养基培养24h；同型半胱氨酸组，分别加入终浓度为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L．1000μmol/L的同型半胱氨酸培养24h；盐酸氟桂利嗪组：加入终浓度为10μmmol／L盐酸氟桂利嗪及终浓度分别为100μmol／L、200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L的同型半胱氨酸，培养24h。以上每组各种浓度共8孔。用ELISA法检测各组不同培养条件下可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的吸光度值（波长490nm）。 结果：同型半胱氨酸组中随着培养液同型半胱氨酸浓度的增加可溶性细胞间黏附分子1的吸光度值从（0．143&;#177;0.013）增至（0．175&;#177;0．006），与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；可溶性血管黏附分子1从（0．112&;#177;0．008）增至（0．147&;#177;0．014）．与对照组相比差异有显著性意义（P〈0．01）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋100μmol／L同型半胱氨酸组与相同浓度的同型半胱氨酸组相比吸光度值也减少．差异无显著性意义（P〉0．05）；10μmmol／L的盐酸氟桂利嗪＋200μmol／L、500μmol／L、1000μmol／L同型半胱氨酸组的吸光度均低于相同浓度的同型半胱氨酸组．差异有显著性意义（P〈0．01）；表明盐酸氟桂利嗪明显抑制同型半胱氨酸所诱导的可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的表达。 结论：盐酸氟桂利嗪能够减少同型半胱氨酸引起的人脐静脉内皮细胞株黏附分子的上调，可能对细胞具有保护作用。     

同型半胱氨酸对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成中ABCA1、ACAT1表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成中三磷酸腺苷-结合转运子A1(ABCA1)和酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT1)表达的影响。方法将THP-1单核细胞与佛波酯(PMA)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共同培养,复制泡沫细胞模型,并分别用50、100、200、500μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+叶酸+维生素B12(Vit B12)干预72 h,并设对照组(不加入Hcy)。采用油红O染色检测泡沫细胞的形成。采用酶终点法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)含量的变化,观察Hcy对泡沫细胞CE流出的影响。采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定ABCA1、ACAT1 mRNA表达;免疫印迹法检测ABCA1、ACAT1蛋白表达。结果油红O染色显示Hcy加剧了泡沫细胞的形成,但不呈量效关系。实验组(加入50、100、200、500μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+叶酸+Vit B12)泡沫细胞阳性百分率均高于对照组(P<0.05、P<0.01),以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01)。在Hcy的干预下,泡沫细胞胞内TC、FC、CE流出减少,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01)。100μmol/L Hcy+叶酸+VitB12组与100μmol/L Hcy组比较,前者泡沫细胞形成减少,胆固醇流出增多。RT-PCR结果显示ABCA1 mRNA表达下调,ACAT1 mRNA表达上调,均以100μmol/L Hcy组效应最为明显(P<0.01);免疫印迹法检测ABCA1、ACAT1蛋白的表达与其mRNA表达一致。结论 Hcy下调了ABCA1的表达,上调了ACAT1的表达,促使了泡沫细胞形成。     

硒对动脉平滑肌细胞增殖作用机制的探讨

目的：探讨硒(Se)拮抗同型半胱氨酸(hemocysteine,HCY)刺激大兔动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用机制。方法：首先将兔胸主动脉VSMCs进行培养,然后加入250、500、1000、2000、4000μmol／L不同浓度的D,L-HCY。经MTT方法的检测,选择VSMCs增殖率最适宜的浓度;在加入最适宜l000μmol／LHCY的VSMCs中再分别加入50、100、200μmol／L不同浓度的硒代蛋氨酸(Se-Met)。经姬姆萨染色,通过流式细胞技术观察细胞周期,提取细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定。结果：不同浓度的Se-Met使HCY作用的VSMCs生长明显受到抑制(P<0．05)。但姬姆萨染色没有发现凋亡小体。流式细胞术检测到S期细胞显著减少(P<0.05),未检测到凋亡峰。基因组DNA经琼脂糖电泳也没有发现细胞凋亡的典型梯状图谱。结论：HCY的促细胞增殖作用可能是通过氧化应激介导的,而Se-Met可以拮抗HCY的促平滑肌细胞增殖作用。因实验结果未见与细胞凋亡有关,Se-Met浓度与谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性呈正相关,故考虑Se-Met作用机制之一是与细胞的氧化应激反应有关。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

盐酸氟桂嗪对同型半胱氨酸诱导的正常人脐静脉内皮细胞株胞内钙离子和细胞活性的影响

目的：观察盐酸氟桂嗪对同型半胱氨酸诱导的正常人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）胞质内钙离子浓度和细胞活性的影响。 方法：实验于2005-02／08在西京医院神经内科实验室完成。①分组：将ECV．304分为3组，正常对照组仅予空白RPMI-1640培养基培养；同型半胱氨酸组分别加入终浓度为100，200，500，l000μmol／L的同型半胱氨酸培养；盐酸氟桂嗪组加入终浓度为10μmol／L盐酸氟桂嗪及终浓度分别为100，200，500，1000μmol／L的同型半胱氨酸共培养。②细胞活性检测：用四唑盐法检测，各组细胞加入不同浓度药物培养24h后，测定各孔吸光度值A。③细胞质中[Ca^2＋]i的测定：各组细胞加入不同浓度药物培养20min后，利用Ca^2＋rxj 示剂Flu-3AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的细胞，共聚焦技术检测细胞内荧光强度的变化。 结果：①同型半胱氨酸浓度为200，500，1000μmol／L时各组的反映细胞活性A值低于对照组（0．156&;#177;0．009，0．148&;#177;010，0．134&;#177;0．007，0．177&;#177;0．011，P〈0．01），也低于含同浓度同型半胱氨酸的盐酸氟桂嗪组（0．168&;#177;0．011，0．160&;#177;0．009，0．148&;#177;0．007，P〈0．05,0．01）。且随着同型半胱氨酸浓度的增加，A值逐渐降低。②在同型半胱氨酸组中，随同型半胱氨酸浓度增加反映细胞质中[Ca^2＋]i的平均荧光强度也逐渐增强。同型半胱氨酸各浓度组平均荧光强度均高于对照组（P〈0．01）；也高于含相同浓度同型半胱氨酸的盐酸氟桂嗪组（P〈0．01）。 结论：①同型半胱氨酸对血管内皮细胞有损伤作用，其作用与胞内钙离子浓度升高密切相关。②盐酸氟桂嗪能减轻同型半胱氨酸所诱导的细胞损伤，可能与其直接抑制由同型半胱氨酸所诱导的Ca^2＋的内流，减轻细胞质钙超载有关。     

神经生长因子对多巴胺能神经元凋亡的保护作用

目的：观察6-羟基多巴(6-OHDA)诱导PC12细胞凋亡的作用，探讨神经生长因子(NGF)对PC12细胞凋亡的保护作用。方法：将6孔培养板中的PC12细胞分别加入不同浓度的6-OHDA(0，25，50，100，150和200μmol／L)；同样6-OHDA各组，每孔均加入终浓度为100μg／L的NGF。分别干预24h后终止培养，观察PC12细胞凋亡的程度。用Hoechst33258细胞核染色法、凋亡细胞的DNA裂解分析一琼脂糖凝胶电泳、TUNEL原位凋亡检测和计算机自动图像分析等方法进行凋亡检测。结果：6-OHDA50，100，150和200μmol／L均不同程度地诱导了PC12细胞凋亡，表现剂量效应。NGF对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用[NGF组比8KNG组：细胞核面积：(56.48&;#177;3.06）比（36．19&;#177;2.15)μm^2，光密度：0.38&;#177;0．03比0．53&;#177;0.3，t=2．36、3.07、P&;lt;0．05。结论：支持6-OHDA在体外能够诱导PC12细胞凋亡的观点，并且有剂量效应。NGF对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。     

体外神经干细胞培养过程中蛋白激酶磷脂酰肌醇-3激酶／AKT信号途径的作用

目的：探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，P13K)／AKT信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用。方法：实验于2001-11／2004-04在重庆医科大学神经病学研究所完成。分为对照组、P13K特异性抑制剂wortmannin组和LY294002组；采用间接免疫荧光法检测nestin，NF-200和GFAP的表达；TUNEL评价细胞凋亡率；Western Blot法检测磷酸化的AKT，caspase-9和bad的表达。结果：随着wortmannin和LY294002浓度增大，神经干细胞的形态变化逐渐明显，而且细胞凋亡率也逐渐增加。低浓度时(wortmannin浓度为5nmol／L，LY294002浓度为2μmol／L)，神经干细胞凋亡率与对照组无显著性意义(P&;gt;0．05)；高浓度时(wonmannin浓度为50，100nmol／L，LY294002浓度为50，100μmol／L)，神经干细胞凋亡率与对照组、低浓度组有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。Western Blot结果提示，随着PI3K特异性抑制剂浓度增大，磷酸化AKT的表达逐渐减弱。当高浓度woftmannin(20nmol／L)和LY294002(10μmol／L)抑制了AKT磷酸化后，磷酸化的caspase-9，Bad表达减弱。此外，将wortmannin组和LY294002组存活的细胞接种后，分化后细胞的NF-200，GFAP表达无显著性意义。结论：神经干细胞存活依赖于PI3K／AKT途径的活化，其机制可能是PI3K／AKT活化后，促进了Bad和caspase-9等蛋白的磷酸化，抑制了细胞凋亡事件的发生。但是PI3K／AKT途径可能在神经干细胞的分化中的作用甚微。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对同型半胱氨酸促血管平滑肌细胞增殖的保护作用

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在同型半胱氨酸(Hcy)促血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中的保护作用。方法采用不同的实验试剂培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs),分为对照组(control)、Hcy组(Hcy 100、200、500、1 000μmol/L)、EGCG组(EGCG 5、10、20μmol/L)、Hcy+EGCG组(Hcy 500μmol/L+EGCG 5μmol/L、Hcy 500μmol/L+EGCG 10μmol/L、Hcy 500μmol/L+EGCG 20μmol/L),在培养的24 h,采用CCK-8法、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)标记法观察细胞增殖情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管紧张素Ⅱ(Ang II)浓度,Western印迹法测定Ang II受体1(AT-1R)蛋白表达水平。结果干预24 h后,与对照组相比,Hcy各组细胞增殖均显著增加(P0.05),EGCG 10、20μmol/L组细胞增殖显著减少(P0.05);与Hcy 500μmol/L组相比,加入EGCG 10、20μmol/L干预后细胞增殖显著减少(P0.01),Ang II浓度及AT-1R蛋白表达水平显著降低(P0.01)。结论 EGCG可抑制Hcy诱导的VSMCs增殖。     

复方苦参注射液联合热疗抗血管生成作用的实验研究

目的探讨复方苦参注射液联合热疗对体内外血管生成的抑制作用。方法采用MTT法观察复方苦参注射液联合热疗对人脐静脉内皮细胞（讯舰C）、人结肠癌LOVO细胞增殖的影响；采用transwell板，观察复方苦参注射液对HUVEC迁移的影响；采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型，观察复方苦参注射液对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果复方苦参注射液在6．25～200μL/L时具有抑制HUVEC增殖的作用（细胞存活率82．2％-32．5％），与浓度呈负相关（相关系数r及P值分别为一0．972、0．001），此浓度范围内对人结肠癌LOVO细胞增殖的抑制明显低于对HUVEC的抑制，具有明显的抗血管生成作用。12．5μL／mL和25μL／mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的协同效应，6．25μL／mL、50μL／mL、100μL／mL和200μL／mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的次加效应。复方苦参注射液在3．125～25μL／mL时具有抑制HUVEC迁移的作用，在12．5-50μL／mL时对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管具有明显的抑制作用。结论小剂量复方苦参注射液在体内外具有抑制血管生成作用，联合热疗具有协同或次加效应。     

盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的干预

目的:观察盐酸氟桂利嗪对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞株黏附分子表达的影响。方法:实验于2005-02/08在西京医院神经内科实验室完成。人脐静脉内皮株细胞培养,取第4～7代指数生长期细胞,接种到96孔板,24h细胞贴壁后换液,加入药物处理。随机分为正常对照组、同型半胱氨酸组及盐酸氟桂利嗪组3组,正常对照组,仅予空白RPMI-1640培养基培养24h;同型半胱氨酸组,分别加入终浓度为100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的同型半胱氨酸培养24h;盐酸氟桂利嗪组:加入终浓度为10μmmol/L盐酸氟桂利嗪及终浓度分别为为100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的同型半胱氨酸,培养24h。以上每组各种浓度共8孔。用ELISA法检测各组不同培养条件下可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的吸光度值(波长490nm)。结果:同型半胱氨酸组中随着培养液同型半胱氨酸浓度的增加可溶性细胞间黏附分子1的吸光度值从(0.143±0.013)增至(0.175±0.006),与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01);可溶性血管黏附分子1从(0.112±0.008)增至(0.147±0.014),与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01);10μmmol/L的盐酸氟桂利嗪 100μmol/L同型半胱氨酸组与相同浓度的同型半胱氨酸组相比吸光度值也减少,差异无显著性意义(P>0.05);10μmmol/L的盐酸氟桂利嗪 200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L同型半胱氨酸组的吸光度均低于相同浓度的同型半胱氨酸组,差异有显著性意义(P<0.01);表明盐酸氟桂利嗪明显抑制同型半胱氨酸所诱导的可溶性细胞间黏附分子1和可溶性血管细胞黏附因子1的表达。结论:盐酸氟桂利嗪能够减少同型半胱氨酸引起的人脐静脉内皮细胞株黏附分子的上调,可能对细胞具有保护作用。     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的：观察2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用，探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制。为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法：不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol／L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6，24h，加人工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol／L)孵育24h或500μmol／L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率，细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)。结果：①50～400μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降，随剂量增加，保护作用上升，至200μmol／L保护作用最强。200，400μmol／L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol／L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH％增多恢复正常。②5μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h，即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH％增多[LDH％：(62．47&;#177;2．43)％；MTT(A)：0.1093&;#177;0.0074]，至200μmol／L保护作用最强[LDH％：(46．10&;#177;2．10)％；MTT(A)：0.2487&;#177;0.0283]。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，5～400μmol／L二苯乙烯甙均能拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多(P&;lt;0.05)，呈明显剂量依赖关系，且各浓度保护作用均较药物预孵育6h增加，200μmol／L二苯乙烯甙组细胞存活率及LDH％基本恢复正常。结论：二苯乙烯甙对β-淀粉样蛋白和过氧化氢致神经细胞存活率下降及乳酸脱氢酶漏出增多有明显拮抗作用。二苯乙烯甙作为何首乌的主要有效成分对老年性痴呆等神经系统退性行疾病的防治有良好应用前景。     

类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中白藜芦醇的诱导作用及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化

目的 探讨来自植物中的天然活性成分白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中，凋亡执行因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化状态及其参与作用，并分析其浓度与时间作用。方法：实验于2003-05／10在中南大学湘雅二医院中心实验室完成。人类风湿关节炎滑膜组织取自中南大学湘雅二医院骨科2003-05诊治的1例男性50岁患者。①将手术切取的滑膜组织，剔除脂肪及纤维组织后经清洗、剪碎、消化、离心、培养、传代、获得3-5代细胞，电子显微镜观察滑膜细胞生长过程中的形态变化。②将细胞分为3组，对照组(未用药处理的滑膜细胞)；白藜芦醇组(50，100，200，400μmol／L白藜芦醇处理12h的细胞及用200μmol／L白藜芦醇处理4，8，12，18，24h的细胞)；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂+白藜芦醇组(先用1mmol几天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂预处理2h，再用白藜芦醇处理的滑膜细胞)，各组均设3复管。③比色法测定用200μmol/L白藜芦醇处理后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性；不同浓度的白藜芦醇处理12h后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性。④采用Western-blot分析不同浓度白藜芦醇处理24h的类风湿关节炎滑膜细胞，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的裂解。⑤实验设计为分组匹配对照。结果：①滑膜细胞培养过程中形态学改变：组织块贴壁后三四天，周边有少量滑膜细胞游走爬出。细胞呈多边形或长梭形，有两个或多个突起。培养7d左右，细胞数目增多，逐渐融合。得到第1代滑膜细胞。传代2次以上的滑膜细胞性状稳定，细胞形态以成纤维样细胞为主。②用200μmol／L白藜芦醇分别处理类风湿关节炎滑膜细胞4，8，12，18，24h．天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性于4h后明显升高，12h达高峰，持续至24h以上，白藜芦醇组不同处理时间与对照组比较，均显著增高(P&;lt;0．05)。③对照组及用50，100，200，400μmol／L白藜芦醇处理滑膜细胞12h，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性分别为(1．00&;#177;0．07)、(1．80&;#177;0．17)、(1．96&;#177;0．18)、(2．45&;#177;0．17)、(3．25&;#177;0．24)，呈浓度依赖性的升高，白藜芦醇组不同浓度与对照组均显著增高(P&;lt;0．05)。④对照组及用50，100，200，400μmol／L处理培养的类风湿关节炎滑膜细胞24h，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的表达随药物浓度的增加而减少，100μmol/L时开始出现活性裂解片断P11(Mr11000)，400μmol/L时P11增加。结论：①不同浓度的白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞12h和200μmol／L白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性在4h开始升高，12h达高峰后缓慢下降，提示此现象具有浓度和时间的依赖性。②白藜芦醇浓度为400μmol／L时出现天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性裂解片断P11(Mr11000)吸光度积分值高于100μmol／L，证实了在白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3被活化，并发挥了作用。     

构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型验证球形脂联素的拮抗作用

目的：构建游离脂肪酸(棕榈酸)诱导胰岛细胞凋亡模型，并观察球形脂联素对胰岛细胞凋亡的拮抗作用。方法：实验于2004—15／2005—30在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型及分组：采用小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1，取对数生长期的细胞，按1&;#215;10^5个／孔的密度接种于6孔板，细胞生长至80％融合时将随机细胞分为3组，每组3孔，分别为对照组，棕榈酸组，棕榈酸+球形脂联素组。3组培养基均含5g／L的牛血清白蛋白、体积分数为0．03胎牛血清及体积分数为0．01的无水乙醇；棕榈酸组又加含有终浓度为500μmol／L棕榈酸；棕榈酸+球形脂联素组又加终浓度为500μmol／L棕榈酸和0．5mg／L脂联素。处理48h后终止实验。采用Hochest33342和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡率和凋亡指数及脂联素处理后脂性凋亡的改善情况。结果：①经Hochest33342染色检测3组小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数明显不同(F=300．270，P&;lt;0．05)。棕榈酸组明显高于对照组[(12．40&;#177;1．57)％，(2．05&;#177;0．59)％]，说明500μmol／L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型，经脂联素处理后凋亡指数明显降低[(12．40&;#177;1．57)％，(3．87&;#177;0．93)％]，说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。②经脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数3组明显不同(F=191．221，P&;lt;0．05)，棕榈酸组明显高于对照组[(26．33&;#177;5．6)％．(2．32&;#177;0．78)％]，说明500μmol／L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型，经脂联素处理后凋亡指数明显降低[(2．32&;#177;0．78)％，(4．90&;#177;0．82)％，P&;lt;0．05]说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。结论：①Hoescht染色法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法结果均表明在体积分数为0．03胎牛血清、5g／L的牛血清白蛋白的Dulbecco改良的Eagle培养液条件下加入终浓度为500μmol／L棕榈酸处理细胞48h可成功构建胰岛细胞凋亡的细胞模型。②球形脂联素可拮抗胰岛细胞的脂性凋亡，从而发挥了其调节糖脂代谢的作用。     

氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的作用

背景：氯胺酮是临床常用的静脉全麻药，静脉或硬脊膜外腔用药都有镇痛作用，它是N-甲基-D-天冬氨酸受体非竞争性拮抗剂，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用。 目的：观察氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。 设计：随机对照观察。 单位：郧阳医学院附属太和医院麻醉科。 材料：实验于2003-09／2005-01在郧阳医学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成。由武汉大学动物实验中心提供新生两三天Wistar大鼠。 方法：取Wistar大鼠T11～L6脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养。胶质纤维酸性蛋白鉴定星形胶质细胞纯度达98％后用于实验。将培养细胞24孔板随机分为6组（每组9份）：①对照组加Hanks液50μL。（爹N-甲基-D-天冬氨酸组加药浓度为100μmol／L。（爹氯胺酮组加药浓度为1mmol／L。④100μmol／L N-甲基-D-天冬氨酸＋0．1mmol／L氯胺酮组。⑤100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋0．5mmol／L氯胺酮组。⑥100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组。1mmol几氯胺酮为临床镇痛剂量。培养24h后检测超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量，免疫细胞化学观察Bcl-2蛋白和形态学变化，流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率。 主要观察指标：①Bcl-2蛋白免疫组织化学苏木精-伊红复染细胞着色及形态学变化。②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率。③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化。 结果：①Bcl-2平均吸光度值似）作为半定量测量Bcl-2蛋白表达水平：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组低于对照组，差异显著[分别为0．0544&;#177;．021，0．108&;#177;0．039，P〈0．01]，100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组高于100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组，差异显著[分别为0．148&;#177;0．045，0．054&;#177;0．021，P〈0．01]。②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组高于对照组，差异显著[分别为（25．26&;#177;6．13）％，（5．66&;#177;2．24）％，P〈0．01]，100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋1mmol／L氯胺酮组低于100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸组，差异显著[分别为（24．41&;#177;4．82）％，（25．26&;#177;6．13）％，P〈0．01]。③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化：100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸使星形胶质细胞内丙二醛含量显著升高，而超氧化物歧化酶活性明显降低；1mmol／L氯胺酮明显降低丙二醛含量，显著增强超氧化物歧化酶活性，该效应在临床镇痛剂量以内有明显量效关系，与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异显著（P〈0．01）。1mmol／L氯胺酮组与对照组相比、100μmol／LN-甲基-D-天冬氨酸＋0．1mmol/L几氯胺酮组与N-甲基-D。天冬氨酸组相比差异均无显著性。 结论：N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活可诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞大量凋亡，适量氯胺酮显著抑制细胞凋亡，其机制可能增强星形胶质细胞Bcl-2蛋白表达，同时抑制自由基的产生和增强超氧化物歧化酶活性。     

油茶皂苷C对脐静脉内皮细胞缺氧及复氧损伤时的影响

目的：研究脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧／复氧损伤(A／R)时，单核细胞与内皮细胞黏附及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达并观察油茶皂苷C(SQS-C)对此的影响。方法：内皮细胞A／R前3h，分别加入终浓度为0．1，1．0和10．0μmol／L SQS-C，再A／R 5h，比色法测定内皮细胞与单核细胞的黏附率，RT-PCR法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达。结果：A／R时，单核细胞与内皮细胞的黏附显著增加(P&;lt;0．01)：SQS-C能明显降低细胞黏附率，减少内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达(P&;lt;0．05)，并呈剂量依赖性。结论：SQS-C能抑制缺氧／复氧损伤的内皮细胞与单核细胞的黏附，减少内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达。     

肿瘤坏死因子α诱导人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603凋亡的作用

目的：观察不同浓度重组肿瘤坏死因子α对于培养的人原代成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603的凋亡作用，并分析浓度效应。方法：实验于1998-04／2000—04在第二军医大学卫生毒理学教研室完成。在人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603中，实验组加浓度为1，10，100，1000ng／L的肿瘤坏死因子α，对照组加等量的无肿瘤坏死因子培养基，培养后检测细胞活力应用噻唑兰法，检测细胞凋亡情况应用DNA梯形条带和透射电镜等方法。结果：①肿瘤坏死因子α对培养成骨细胞和HOS-8603细胞的作用（噻唑兰法）：肿瘤坏死因子α浓度为100和1000ng／L实验组均高于对照组[成骨细胞：（0．14&;#177;0．006），（0．10&;#177;0．010），（0．27&;#177;0．013）ng／L：HOS-8603细胞：（0．15&;#177;0．012），（0．09&;#177;0．015），（0．27&;#177;0．013）ng／L,P〈0．05]。②DNA梯形条带结果：凋亡细胞使DNA在核小体外降解。形成180～200bp或与之成倍的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳时呈现梯形结果。在肿瘤坏死因子α浓度为1000ng／L时，成骨细胞可检测到典型DNA梯形条带。③成骨细胞的凋亡情况：应用透射电镜检查。浓度为1000ng／L实验组较浓度为100ng／L实验组凋亡细胞多。肿瘤坏死因子α同样可以诱导HOS-8603的凋亡，未加肿瘤坏死因子α时，凋亡很少。加入100ng／L及1000ng／L肿瘤坏死因子α时，凋亡细胞数量明显增加。结论：肿瘤坏死因子α质量浓度达到100g／L时，可以引起体外培养的成骨细胞和成骨细胞系HOS-8603细胞凋亡，并随浓度加大出现凋亡细胞增多的剂量-效应关系，结果验证了肿瘤坏死因子能刺激成骨细胞凋亡的假说。     

慢性肾功能衰竭对血浆同型半胱氨酸水平的影响

目的：探讨慢性肾功能衰竭(CRF)患者其排泄障碍对血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的影响。方法：对56例CRF患者及52例对照组应用荧光偏振免疫分析法测定SHcy、尿Hcy(UHcy),计算Hcy清除率(CHcy)。同时测定叶酸、维生素B12、肾功能、血脂、血压。结果：CRF组UHcy、CHcy显著低于对照组(P=0．000),SHcy、叶酸、维生素B12显著高于对照组(P=0．001)。SHcy≥16μmol／L组UHcy、CHcy显著低于SHcy<16μmol／L组(P=0.003)。纠正了肾功能因素后SHcy≥16μmol／L组UHcy、CHcy仍显著低于SHcy<16μmol／L组(P=0．001)。但叶酸、维生素B12水平两组差异无显著性(P>0．05)。结论：SHcy升高主要是肾脏代谢、排泄Hcy障碍,而非叶酸、维生素B12绝对缺乏。     

川芎嗪对花生四烯酸诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用

目的：研究川芎嗪对花生四烯酸(160μmol／L)诱导的血管内皮细胞损伤和凋亡的保护作用及其机制。方法：MTT法检测细胞存活率，比色法测LDH释放率和细胞MDA含量，Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态变化并测定凋亡率，琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解。结果：川芎嗪(0．25，1．00mmol／L)能浓度依赖性抑制花生四烯酸引起的细胞存活率下降(t=2．52，3．14，P&;lt;0.05)，并降低细胞LDH释放率和MDA含量(t=3．27，5．88和t=4．64～7．41，P&;lt;0.05)。花生四烯酸处理24h后的细胞呈现典型的凋亡核固缩表现，凝胶电泳显示DNA凋亡梯带。川芎嗪(0.25～1．00mmol／L)能降低其凋亡率。结论：川芎嗪对花生四烯酸引起的内皮细胞损伤和凋亡具有保护作用，其机制可能与其抗脂质过氧化作用有关。     

吲哚美辛诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

背景：一些与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞凋亡相关的疾病均与炎症刺激有关。目的：探讨用吲哚美辛诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞的凋亡。设计：随机对照、单盲法的前瞻性研究。地点和对象：实验在中南大学湘雅二院实验中心进行，胎儿标本来源于中南大学湘雅二院妇产科。干预：加入终浓度分别为100，200，400，600umol／L的吲哚美辛作用24h；600umol／L作用6，12，24后用透射电镜定性观察凋亡细胞，并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。主要观察指标：凋亡RPE细胞形态和数量的变化。结果：经200，400，600umol／L吲哚美辛作用24h后RPE细胞凋亡数为(2．7000&;#177;1．3375)，(5．1000&;#177;1．3703)，(6．8000&;#177;1．6865)，与对照组(0．2000&;#177;0．4216)相比，差异有显著性意义(t值分别为4．624，9．062，12．206，P&;lt;0．01)，随着吲哚美辛浓度的增加，RPE细胞凋亡数逐渐增多；600p,mol／L吲哚美辛作用12，24h后RPE细胞凋亡数为(4．4000&;#177;0．8433)，(6．4000&;#177;1．2649)，与对照组(0．2000&;#177;0．4216)相比，差异有显著性意义(t值分别为8．617，13．274，P&;lt;0．01)。结论：吲哚美辛能诱导体外培养的人胚胎RPE细胞的凋亡，并且RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多。