荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的实验研究

目的建立荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的方法。方法选取出生1 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射水合氯醛麻醉后,剪开头部皮肤,向双侧上丘各注射4%荧光金注射液1μl,缝合皮肤,4 d后处死,提取视网膜,胰酶消化后培养,显微镜下观察被标记的视网膜神经节细胞。结果混合培养的视网膜细胞中,可见被荧光金标记的视网膜神经节细胞,大约占细胞总数的0.34%,视网膜神经节细胞可存活3周。结论荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞是一种可行的方法,可用于视网膜神经节细胞的鉴定。     

霍乱毒素及视神经植块对视网膜节细胞存活的影响

目的　探讨霍乱毒素及视神经植块对视神经切断后视网膜节细胞存活的影响。方法　研究采用荧光逆行示踪标记法和定量解剖学技术。结果　 ( 1 )切断视神经 5、7及 1 4天后 ,视网膜节细胞平均密度分别为 1 1 93.8± 94.2 mm2 、846.9± 5 5 .6 mm2 及 2 1 7.5± 40 .3 mm2 。 ( 2 )给予霍乱毒素组在 5d、7d及 1 4d ,视网膜节细胞的密度分别为 1 386.3± 88.0 mm2 ,1 1 96.9± 75 .2 mm2 及 396.3± 72 .4 mm2 ,与切断视经组相比在各时间段差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。 ( 3)玻璃体植入视神经组在 5天、7天及 1 4天视网膜节细胞的密度分别为 1 367.4± 90 .8 mm2 ,1 1 40 .6± 83.5 mm2 及 2 38.8± 37.3 mm2 ,与对照组相比 ,在 5天及 7天组差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而 1 4天组差异无显著性 (P >0 .0 5 )。 ( 4 )联合给予霍乱毒素及视神经植块 ,在 5、7、1 4天视网膜节细胞的平均密度分别为 1 660 .6± 93.1 mm2 ,1 385 .6± 94.1 mm2及 5 5 6.4± 93.1 mm2 ,与神经切断组及单纯给予霍乱毒素或视神经组相比 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　 ( 1 )CTx和视神经植块都分别能促进受损视网膜细胞存活。 ( 2 )联合应用CTx和视神经植块 ,可显著提高受损视网膜节细胞存活     

大鼠视神经切断后视网膜Muller细胞及小胶质细胞变化特点

目的观察视网膜Muller细胞和小胶质细胞在大鼠视神经切断后的变化特点．方法应用大鼠视神经完全横断模型,随机分为术后1d、3d、7d、14d4个损伤组和假手术组（每组n=5）;分别用Muller细胞和小胶质细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（GS）和OX-42,进行免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结（sP）法染色,以显示视网膜Muller细胞和小胶质细胞的变化．结果在视神经切断后,大鼠视网膜Muller细胞GS阳性产物立即增粗、深染,并与周围细胞紧密联系在一起,3d达高峰,14d明显减弱;小胶质细胞OX-42的阳性产物表达在视神经切断后7d明显增强,14d达高峰．结论视神经切断后大鼠视网膜Muller细胞反应性增生,小胶质细胞被激活,但反应高峰晚于Muller细胞,其作用有待进一步研究．     

霍乱毒素对成年金黄地鼠视网膜节细胞凋亡的影响

为探讨霍乱毒素对神经细胞凋亡的影响,手术切断成年金黄地鼠视神经,用荧光染色技术,研究玻璃体注射霍乱毒素对视网膜节细胞凋亡的影响。观察结果如下：（１）切断视神经７ｄ后,霍乱毒素实验组和对照组的凋亡细胞平均密度分别为４０±３．７２个／ｍｍ２,５３．４４±４．２３个／ｍｍ２;凋亡细胞与成活细胞的平均比率分别为（３．３６±０．３１）％,（６．３８±０．５１）％。与对照组相比,实验组的凋亡细胞密度及凋亡率均下降（Ｐ值均＜０．０１）;（２）切断视神经１４ｄ后,实验组与对照组数据分别为４５．３１±２．２８个／ｍｍ２、３０．９４±２．６３个／ｍｍ２及（１０．９７±０．５５）％、（１５．３９±１．３１）％。实验组凋亡细胞密度虽有增加,但其凋亡率仍下降（Ｐ值均＜０．０１）。以上结果提示,霍乱毒素能抑制视神经切断的成年金黄地鼠视网膜节细胞的凋亡。     

荧光金在视神经损伤研究中的应用

目的 研究荧光金在视神经损伤中的应用。方法 荧光金注射到正常及不完全视神经损伤后大鼠的外侧膝状体和上丘，观察视网膜铺片中视网膜神经节细胞的形态和数量；荧光金注射到大鼠玻璃体腔内，观察视网膜神经节细胞轴突的损伤情况。结果 视网膜铺片的节细胞边界清晰，易于计数和形态的观察。损伤2周时视网膜神经节细胞剩余57％，相对应的损伤2周的轴突远端的线形荧光明显减少。结论 荧光金是视神经损伤中视网膜神经节细胞数目变化和轴突损伤、分布和投射的可靠有效方法。     

霍乱毒素对视神经扎断后视网膜节细胞轴突再生的作用

[目的]探讨霍乱毒素(CTx)对成年金黄地鼠视神经扎断(microcrush,MC)后视网膜节细胞(RGCs)轴突再生的促进作用。[方法]扎断成年金黄地鼠视神经近端,玻璃体内注射CTx,或插入小段坐骨神经分支(SN)。动物随机分为实验组和对照组:对照组分为单纯扎断视神经组(MC)和MC+溶剂组;实验组包括MC+CTx组、MC+CTx+SN组、量效关系组。量效关系组动物存活4周,其余各组动物存活3～5周。用荧光金逆行标记再生的RGCs,在荧光镜下观察视网膜平铺片再生 RGCs的数量变化。[结果]CTx不同剂量组125、250、500和1000 ng视网膜再生RGCs平均数分别为(130±46)、(189±91)、(358±84)、(94±34)个/视网膜,比MC组或MC+溶剂组显著增加,具有统计学意义(P<0.01),以500 ng/眼的剂量最佳。在3、4和5 W时MC+CTx组的视网膜再生RGCs平均数分别为(503±123)、(345±98)、(57±25)个/视网膜;MC+CTx+SN组为(771±199)、(432±105)、(160±76)个/视网膜,均比MC组或MC+溶剂组明显增加(P<0.01)。[结论]提示霍乱毒素或联合玻璃体内植入坐骨神经具有显著促进视神经扎断后视网膜节细胞轴突再生的作用。     

激肽释放酶结合蛋白对大鼠视神经不完全损伤后视网膜神经细胞的保护作用及轴突再生的研究

目的 探讨激肽释放酶结合蛋白(KBP)是否对体内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存在保护和促进其轴突再生的作用.方法 在距SD大鼠视神经球侧端0.5～1.0mm的地方夹持视神经,造成大鼠视神经不完全性损伤;在大鼠视神经损伤的模型中,行玻璃体腔分别注入KBP作为实验组和PBS为对照组;分别于损伤后7d,14d和21d取材,HE染色观察视网膜结构、测量视网膜厚度及RGCs的存活数量;提取术眼视神经行蛋白免疫印迹.根据统计学分析结果,明确KBP是否有视网膜神经节细胞保护和促进其轴突再生作用.结果 ①大鼠不完全视神经损伤模型建立成功.②通过HE染色,我们观察了视网膜各层结构变化,通过双肓法计数RGCs,和视网膜厚度测量,经统计学分析,组间差异具有统计学意义.③对神经再生的标记蛋白GAP-43进行Western-blot,统计学分析,组间GAP-43表达差异具有统计学意义.结论 ①KBP对视神经损伤后的RGCs具有保护作用.②KBP在视神经损伤后可能促进了视神经的轴突再生.     

猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构

目的：建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)的体外培养方法,并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法：进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养,观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况,研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用。结果：视网膜细胞混合培养时,神经节细胞生长良好,纯化后的神经节细胞间连接减弱,细胞存活时间缩短。结论：视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长。     

Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。     

压力对视网膜神经节细胞存活及突起生长影响的研究

目的　建立体外加压培养SD乳鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)模型 ,并观察压力对RGCs存活及突起生长状况的影响。方法　取生后 0～ 3天SD乳鼠的视网膜组织 ,用酶化学方法制备成细胞悬液并接种于培养瓶中。用自行设计的体外加压模型 ,使瓶内压力分别达到 2 0mmHg、4 0mmHg、6 0mmHg和 80mmHg,同时设对照组 (压力为 0 )。分别于培养后 2 4h、4 8h和 72h在倒置显微镜下观察RGCs的存活及生长状况 ,并应用Thy 1 .1单克隆抗体对RGCs进行免疫细胞化学鉴定。结果　压力为 2 0mmHg及 4 0mmHg实验组中RGCs生长状况与对照组相似 ,RGCs存活数量及突起生长率无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;压力为 6 0mmHg及 80mmHg实验组中RGCs存活数量及突起生长率与对照组存在显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论　RGCs可以在体外存活并生长 ,一定的压力 (≥ 6 0mmHg)可以影响RGCs的存活数量及突起生长率。     

Culture of rat retinal ganglion cells

This study aimed to modify the mixed and purified culture of rat retinal ganglion cells(RGCs) in vitro.The retinae of 1-3 day old Sprague-Dawley(SD) rats were separated bluntly into two layers:inner layer and outer layer,under a surgical microscope.Retinal cells isolated from different layers(inner layer,outer layer and whole retinal tissue) by using enzyme dissociation method were cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.After 3-day culture,the RGCs in the retinal cells obtained from mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue were identified by immunocytochemical staining of Thy-1.1,and the rate of RGCs to retinal cells(RGCs%) was calculated.Two monoclonal antibodies,anti-macrophages/granulocytes(OX-41) against rat macrophage and antibody against rat Thy-1.1(OX-7),were used to purify RGCs by either a conventional or modified two-stepped immunopanning procedure(purification in situ).Purified RGCs were seeded at different cell density and cultured in F12/DMEM medium containing 15% FBS.Immunocytochemical staining for Thy-1.1,MTT,and PI-Hoechst33342 fluorescence imaging were used to identify the purity and the viability of RGCs in purified culture of RGCs.The results showed:(1) Immunocytochemistry of different retinal tissue layers culture revealed that the RGCs% was(19.9±1.2)%,(0.5±0.2)%,and(6.2±1.7)% respectively in the mixed culture of inner,outer,and whole retinal tissue,with differences being significant(P<0.05);(2) fluorescent double staining of Hoechst33342 and PI indicated that with the same RGCs%,RGCs obtained from purification in situ grew well with more neurite outgrowth than those by the conventional two-stepped immunopanning method;(3) the viability of purified RGCs seeded at high density was in-creased and the cells developed complex intercellular networks.The viability of RGCs was declined with the decreasing seeding density,and most cells presented round or oval in shape with thin neurites.It was concluded that:(1) RGCs% in the inner layer retina was higher than that in the outer layer retina;(2) RGCs obtained by in situ purification had more neurite outgrowth and lower mortality than those by conventional two-stepped immunopanning procedure;(3) the viability of purified RGCs could be increased by increasing cell seeding density to some extent.     

孕酮对慢性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的：建立大鼠慢性高眼压模型，检测孕酮对高眼压下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法：通过烧灼3条巩膜上静脉制作慢性高眼压动物模型，此模型按腹腔注射不同浓度的孕酮而分为高、中、低浓度孕酮注射组及空白对照组，左眼为模型眼，右眼为自身对照眼，3个月后处死动物，取眼球制石蜡切片，行HE染色、Thy-1.1免疫组化染色及TUNEL原位凋亡检测。结果：各组模型眼比较，高浓度孕酮注射组视网膜神经节细胞数多于低、中浓度孕酮注射组及空白对照组（P<0.05），且TUNEL阳性细胞数也少于低、中浓度孕酮注射组及空白组(P<0.05)。结论：孕酮对慢性高眼压模型大鼠的视网膜神经节细胞有保护作用，并且此保护作用与孕酮的浓度有关。     

成熟视网膜神经节细胞三维培养

目的:建立成熟视网膜神经节细胞的三维培养模型。方法:将边长500 μm的方形网膜片神经纤维层向下浸入12孔培养板的胶原溶液层中,胶原溶液凝固后,培养孔内加入无血清MEM培养液。相差显微镜观察生长情况。应用羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体鉴定培养的神经节细胞突起。结果:视网膜神经节细胞突起在凝胶中呈螺旋迂曲生长,可存活2周以上。免疫组化荧光显色神经节细胞突起呈阳性反应。结论:应用凝胶做支持物对成熟视网膜神经节细胞进行三维原代培养,是一种成功的、可广泛应用的培养方法。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.