小鼠CD86基因启动子的构建及活性分析

为构建小鼠CD86启动子,并对其特异性调控能力进行鉴定。首先自C57BL/6J小鼠基因组中采用高保真PCR扩增小鼠CD86基因的启动子,经测序鉴定后,插入pCDNA3.1-EGFP重组质粒。然后分别转染小鼠来源细胞株:RAW264.7、NIH/3T3、P815、SP2/0、EL4细胞,观察各细胞内绿色荧光蛋白的表达。结果显示,小鼠CD86基因启动子的序列与GenBank报道一致;双酶切鉴定证实小鼠CD86启动子序列已经克隆入重组载体;小鼠CD86启动子能调控EGFP在巨噬细胞系RAW264.7细胞中表达,不能调控EGFP在NIH/3T3、P815、SP2/0和EL4非抗原提呈细胞内表达。说明成功构建小鼠CD86基因启动子,且该启动子具有特异性调控目的基因表达的活性。     

AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达

目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 并检测其在真核细胞内的表达.方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因, 将其克隆至pIRES2-EGFP载体, 构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP.RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因, 克隆至pafpIRES2-EGFP, 进行酶谱分析及DNA序列测定.利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞, 倒置相差荧光显微镜下观察, RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化.结果:SOE-PCR方法获得长度为537 bp的AFP和ECMV嵌合基因, 克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP.PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP, 获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 细胞转染分析证实, 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达, RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高.结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β, 该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β.     

人防御素-5基因的克隆和真核表达载体的构建

目的对人防御素5(HD-5)基因进行克隆,构建真核表达载体HD5-pPICZαA。方法从人cDNA文库中PCR扩增HD-5基因片段,用EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切HD-5基因扩增产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA,用T4DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,然后转化到E.coli Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和序列鉴定。结果提取阳性克隆的重组质粒,EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后跑电泳获得预期条带;同时重组质粒经序列测定,证实HD-5基因正确插入pPICZαA中,插入位置、方向均正确。结论成功构建人防御素5基因的真核表达载体HD5-pPICZαA,为HD-5蛋白的真核真核表达奠定基础。     

小鼠酪氨酸羟化酶启动子克隆

为了克隆小鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)启动子,并对其特异性调控能力进行研究,本实验采用重叠延伸PCR高保真扩增出小鼠TH启动子片段,测序正确后,重组构建质粒,并用TH启动子调控EGFP基因的表达。然后分别转染MN-9D细胞(TH+)和ECV细胞(TH-),观察EGFP基因在细胞内表达情况。结果显示:扩增出小鼠TH启动子序列与GenBank报道一致;单酶切和质粒PCR鉴定证实小鼠TH启动子和EGFP基因已经克隆入重组质粒中;小鼠TH启动子能调控EGFP在MN-9D细胞中表达,不能调控EGFP在ECV细胞内表达。初步确定克隆的小鼠TH启动子具有特异性调控目的基因表达的能力。     

KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建

为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,最终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

肝癌靶向性超抗原表达载体的构建与鉴定

目的：设计并构建受AFP基因顺式作用元件调控，并经减毒处理的肝癌特异性超抗原表达载体。方法：用新设计的引物作PCR扩增截短的AFP基因启动子和增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述片段与逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点连接，构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体[pLXSN SEA(D227A)-Linker-CD80tm]，并用软件对其开放读框进行分析。结果：成功克隆了截短的AFP基因启动子、增强子、linker-CD80tm和SEA（D227A）。将上述序列连接到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误。结论：AFP基因转录启动元件修饰的SEA表达载体，在基因转录水平定量、定向、特异性调控强有力的细胞和体液免疫活化剂（SEA），为下一步将其作为基因疫苗治疗肝癌奠定了基础。     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

FAA基因治疗及其基因表达调控序列新型重组载体的构建、鉴定

目的：Y国探索新型逆转录病毒载体Lentivector及其基因表达调控序列在造血细胞中的有效表达和基因治疗中的应用,用分子克隆的方法构建Fanconis Anemis(FA)患者A组基因（FANCA基因）基因治疗新型重组载体（Lentivector)和基因表达调控序列（启动子/增强子）,进一步通过内切酶酶切位点鉴定插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的原基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先次质粒Friend基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小、目的基因特异引物PCR扩增特异片段鉴定目的基因。方法：首先将质粒Friend基因表达调控序列（Fr-MuLV E/P)强启动子/增强子插入载体Lentivector pRRLsin-18中相应克隆位点,成为pRRLsin-18FrMuLV(test1);用NotI、NcoI双酶 切载体FochA-FANCA,低溶点胶回收FANCA目的基因片段;应用polylinker、adapter方法多步克隆插入新型载体Lentivector pRRLsin-18(test1)中相应特异克隆位点,获得重组载体sin-18FrMuLVE/P-FA(test2),通过酶切鉴定重组载体插入的基因表达调控序列方向和目的基因的片段大小和方向,筛选正向阳性重组质粒,用PCR法进一步证实插入的FANCA基因片段。结果：挑取的阳性克隆经多个酶酶切鉴定,有Friend质粒390bp基因表达调控序列（Fr-MuLVE/P)和4.5kbFANCA目的基因片段酶切位点,用PCR引物扩增出目的基因相应片段,证明为正向重组体。结论：已成功构建表达FANCA基因的重组逆转录病毒载体及其基因表达调控序列,为进一步应用FANCA基因的新型重组载体Lentivector经包装后转染造血干细胞及其表达情况和相应的FAA基因治疗奠定了良好的工作基础。     

小鼠α烯醇化酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠α烯醇化酶（En01）基因的真核表达载体。方法以健康小鼠肾脏组织细胞的eDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增Enol基因编码区的全部序列,克隆至真核细胞表达载体pCDNA3．1^＋中,测序鉴定目的基因用阳离子脂质体转染的方法转染中国仓鼠卵巢CHO细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为1304bp,以此构建重组质粒pCDNA3．1^＋-Enol,测序结果与Gen．bank中的鼠源Enol基因eDNA序列一致。转染中国仓鼠卵巢细胞后可检测到Enol蛋白的表达。结论构建的真核表达载体pCDNA3．1^＋-Enol可在真核细胞内正确表达,这为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的 设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法 采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长，在其5’端连上loxP位点，EcoR I、BamH I双酶切，同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长，并在3’端连上loxP位点，两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，DNA序列分析鉴定重组质粒。结果 SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论 本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化，黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。     

新型双启动子表达质粒pCMVnir的构建及其促进基因免疫效果的研究

目的 构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir，研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用。方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导启动子，根据nirB启动子的结构，设计合成改良的nirB，置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子，而保留其CMVie启动子，获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir，或称为pCN。构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，分别转化S．SL3261、E．coil DH-15a和CHO等细胞，检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性。pCN-EGFP转化S．SL3261，接种BALB／c小鼠，定期解剖小鼠收集黏膜相关淋巴组织，观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性。免疫接种小鼠，并定期收集小鼠血清和阴道分泌物，以重组rEGFP为抗原，用EEISA方法研究其增强免疫应答的能力。并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7，对比三者涛导黏膜免疫的差别。结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因，在细菌中可形成肉眼可见的荧光菌落和沉淀，转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白，表明pC-MVnir载体的两种启动子都有活性，其中nirB活性是受兼性厌氧调控的。pCMVnir与细菌有较好的相容性，重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周，质粒可在细菌中稳定存在。以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP。人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体。结论双启动子表达载体pcMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用，能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度。并可作为一般基因克隆和表达载体，特别是作为原核表达载体，不用添加诱导物，即可获得大量表达。     

巨噬细胞特异性真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人清道夫受体A(SR-A)启动子,构建巨噬细胞特异性的真核表达载体。方法:从人外周血中提取基因组DNA,采用PCR技术分别扩增人SR-A的启动子及第一内含子和增强子序列,并插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pcDNA-GFP中,构建巨噬细胞特异性表达载体pSRA-GFP。将pSRA-GFP转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术比较GFP在不同细胞中的表达水平。结果:成功克隆SR-A启动子,其在巨噬细胞RAW264.7中的表达活性显著高于NRK、LLC、Hepa1-6等非巨噬细胞株(P<0.05)。结论:构建的表达载体pSRA-GFP具有良好的组织细胞特异性,可用于巨噬细胞特异性miRNA表达载体的构建。     

人干燥综合征B抗原重组体的构建及融合表达

目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。