HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠细胞免疫应答

采用HBVCTL表位多肽体外刺激或冲击免疫效 (E)、靶(T)细胞 ,以观察DNA疫苗诱导健康及HBV转基因 (Tg)小鼠细胞免疫效果。结果发现 ,DNA疫苗能有效诱导健康BALB/c小鼠CTL活性 ,活性强弱与E/T比值及其上清液中IFN γ分泌水平有一定关系。HBsAg表位多肽(pp2 0 )体外刺激DNA疫苗免疫组效应细胞 ,培养上清IL 1 2释放水平 (2 1 1 3± 39 8pg/ml)明显较对照组 (86 7±2 7 1 pg/ml)高(P <0 0 5 ,t=4 4 82 )。DNA疫苗免疫HBVTg小鼠诱导CTL活性 (1 2 7%± 6 7% )较蛋白疫苗免疫对照组(1 7%±3 2 % )高(P <0 0 1 ,t=3 6 2 9) ;其效应细胞体外受 pp2 0刺激后分泌IL 1 2水平 (4 0 0± 30 1pg/ml)明显高于同期空载体免疫对照组 (3 8±3 0 pg/ml,P <0 0 5 ,t=2 376 )。采用在体电脉冲法DNA疫苗接种的 5只HBVTg小鼠中 ,于 4周时有 2只血清HBsAg阴转 ,并于 8周时出现抗 HBs阳性 ,而对照组中无一例血清HBsAg发生变化。表明HBVDNA疫苗能有效诱导健康及HBVTg小鼠细胞免疫应答 ,提示其通过增强细胞免疫功能作为抗HBV免疫治疗的可行性     

乙型肝炎病毒患者腹水中HBV感染标志和免疫球蛋白测定

HBsAg在血液、唾液、精液、腹水和脑脊液中均可检出,但在腹水中的阳性率尚不清楚。我们于1986年1月至6月,对血中乙肝病毒指标七项(即HBsAg、抗-HBs、HBcAg、抗-HBc、抗-HBc、HBV-DNA、DNA-P)中有一项阳性的10例腹水患者,测定其腹水中HBV感染标志和免疫球蛋白,现将检查结果报告如下。     

乙肝疫苗对HBV阳性者的安全性和免疫原性观察

为观察HBV感染者注射乙肝疫苗的安全性与免疫原性,我们对HBV感染阳性143例接种了3次不同剂量的乙肝疫苗,并随访1年。发现安全性好,并有较好的免疫原性。1　对象和方法1.1　对象　HBV感染阳性196例,男175例,女21例;年龄17～20岁。先将HBV感染情况分成4层,即HBsAg、抗-HBc均阳性7例,抗-HBs、抗-HBc均阳性101例,仅抗-HBs阳性68例,仅抗-HBc阳性20例。每层再随机分为4组,即乙肝疫苗10μg组,5μg组,2.5μg组与对照组,接受乙肝疫苗接种者共143例(乙肝疫苗购自卫生部北京生物制品研究所)。1.2　方法　第1次接种于三角肌,随后1个月和6个月,…     

急性乙肝患者HBV特异性CD8T细胞受体基因的克隆分析

目的探讨急性乙肝患者HBV特异性CD8 T细胞受体(TCR)参与免疫应答的分子机制。方法分离HLA-A2阳性急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs),用荧光标记的CD3、CD8抗体和五聚体染色,流式细胞仪检测HBsAg183-191和HB-sAg335-343特异性CD8 T细胞频率。取6例患者PBMCs,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养3~4周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA5′末端快速扩增技术获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。确定TCRα、β链基因家族并比较CDR3区序列特点。结果 6例患者样本600多个TCRα、β链克隆基因序列分析结果表明,HBV特异性CD8 T细胞均呈现TCR分子α、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以2~4种α链和1~4种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和23链家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。结论经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CD8 T细胞具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。     

1例急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8 T细胞的快速诱导扩增

目的鉴定急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8 T淋巴细胞识别的优势表位并建立对其进行快速诱导扩增的方法,为研究HBV抗原特异性CD8 T细胞的功能奠定基础。方法从1例HLA-A2阳性的急性乙型肝炎患者外周血分离外周血单个核细胞（PBMC）,使用针对HLA-A2限制性HBsAg表位（S181-181、S335-343）和HBcAg表位（C18-27）的3种HLA-A2/抗原肽荧光标记五聚体试剂（Pentamers）检测HBV特异性CD8 T细胞频率,筛选可能的优势表位。用细胞因子和相应的抗原多肽对PBMC进行1-2周刺激培养,用Pentamers检测特异CD8 T细胞,动态分析特异性CD8 T细胞的增高并用流式细胞仪对其进行分选。结果经过抗原多肽刺激并在合适条件下培养后,HBV特异性T细胞频率显著增高,培养2周时达到高峰,S183-191特异性T细胞从0.21%增高到15.17%,升高了73.8倍;S335-343特异性T细胞占总CD8 T细胞的高分比从0.44%增高到1.79%,升高了3.1倍;但C18-27特异性T细胞的频率很低且刺激培养后无明显升高。结论通过HBV多肽诱导在适当条件下可使抗原特异性CD8 T细胞在短期内获得明显诱导扩增,S-183-191特异性T细胞在控制急性HBV感染中可能具有重要作用。     

HBsAg和抗HBs双阳性慢性HBV感染患者S区主要亲水区新增N-糖基化突变与肝细胞癌发生风险的相关性研究

目的 探讨临床HBsAg和抗HBs双阳性(简称双阳性)慢性HBV感染患者病毒S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变与肝细胞癌(HCC)发生的相关性.方法 纳入2009年7月-2015年6月在解放军302医院就诊的284例双阳性慢性HBV感染患者,通过巢式PCR方法扩增血清样本HBV S基因全序列并进行测序,分析MHR新增糖基化突变和其他临床指标与HCC发生的相关性并动态分析18例双阳性HCC患者临床确诊HCC前后S区新增N-糖基化的突变情况.结果 多因素分析表明,患者年龄＞40岁、HBsAg＞中位数、HBeAg阴性和MRH新增N-糖基化突变是双阳性慢性HBV感染患者发展为HCC的危险因素(分别为OR=4.281,95％CI 1.843～9.941,P=0.001;OR=3.146,95％CI 1.633～6.060,P=0.001;OR=2.097,95％CI 1.010～4.357,P=0.047;OR=4.381,95％CI 1.842～10.417,P=0.001),而丙氨酸氨基转移酶(ALT)、抗HBs＞中位数、抗HBe阳性和HBV DNA水平与HCC发生均无显著相关性.动态研究结果表明,18例双阳性HCC患者样本中有8例在发生HCC 1～4年前已携有新增N-糖基化突变.结论 在双阳性患者中HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HCC发生密切相关,HBsAg和抗HBs双阳性叠加MHR新增糖基化突变可作为慢性HBV感染患者HCC发生风险的预测指标.     

某部干部乙型肝炎病毒感染情况调查

目的：了解某部干部的乙型肝炎病毒感染情况，为防治乙型肝炎提供依据。方法：采静脉血3ml，分离血清后均用ELISA法检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc。结果：HBsAg阳性116例(5．1％)，抗-HBs阳性708例(31．29／6)，HBeAg阳性47例(2．1％)，抗-HBe阳性132例(5．8％)，抗-HBc阳性136例(6．0％)，HBV感染标志阳性299例(13．2%)。HBsAg阳性116例中，合并HBeAg和抗-HBc阳性(“大三阳”)58例(50．0％)；合并抗-HBe和抗-HBc阳性(“小三阳”)30例(25．9%)；合并抗-HBc阳性19例(16．4％)；合并HBeAg阳性4例(3．5％)；HBsAg单项阳性5例(4．3％)。结论：HBV血清学5项(“两对半”)中，除HBeAg阳性率女性显著高于男性外，HBsAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性率男性均显著高于女性，“两对半”阳性率有随年龄增长而上升的趋势，其中抗-HBs和抗-HBs上升趋势更为明显。     

乙型肝炎患者不同血清标志物HBV DNA的表达及意义

 目的探讨血清HBV DNA水平与HBV标志物(HBVM)表现模式的相关性.方法血清HBV DNA定量检测采用PCR ELISA法,HBVM采用ELISA法.结果在HBVM阳性的366例血清中,有199例HBV DNA阳性,占54.4%.血清HB-/ml占65.2%;HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性者HBV DNA-HBc阳性者HBV DNA阳性率占95.2%,≥106 copiessAg、HBeAg、抗阳性率占29.1%,≥106 copies/ml占17.6%.结论血清HBVM阳性患者中约55.0%的血清HBV DNA阳性,且HBeAg阳性患者中HBV DNA含量及阳性率均明显高于抗-HBe阳性者;在抗-HBs、抗-HBc阳性或HBsAg阴性者血清内也有HBV DNA阳性者.     

慢性乙型肝炎血清学标志、HBV DNA定量分析及HBV前C/C变异的临床研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者血清学标志、HBVDNA载量及HBV前C/C变异与临床病变的关系。方法 :随机选取慢性乙型肝炎患者 2 4 6例 ,其中轻度 10 2例、中度 88例、重度 5 6例 ,分别应用ELISA、实时PCR法检测其血清中的HBV免疫学标志及HBVDNA含量。同时对HBeAg阴性而HBVDNA含量高拷贝的 3例轻度、6例中度及 8例重度患者血清 ,应用巢式PCR方法分离前C/C区全长基因 ,纯化后克隆入T载体 ,鉴定后进行序列测定。结果 :10 2例轻度、88例中度及 5 6例重度患者中血清学标志HBsAg ,HBeAg,抗 -HBc阳性模式分别为 5 3例 (5 1.9% )、4 6例(5 2 .3% )、33例 (5 8.9% ) ;HBsAg ,抗 -HBe,抗 -HBc阳性模式分别为 37例 (36 .3% )、32例 (37.5 % )、2 1例 (37.5 % ) ;单独HBsAg阳性为 8例 (7.8% )、5例 (5 .6 % )、1例 (1.7% ) ;其他模式分别为 4例、5例、1例。HBVDNA含量平均值分别为 10E 5 .5 3拷贝 /ml、10E 6 .0 3拷贝 /ml、10E 6 .5 8拷贝 /ml。HBeAg阴性而HBVDNA含量 >10E 6拷贝 /ml的病例数分别为 3例、6例、8例。统计分析表明 ,轻、中、重慢性乙肝患者间血清学标志及HBVDNA含量差异均不具统计学意义 ,而HBeAg阴性HBVDNA含量高拷贝的患者出现频率差异具有统计学意义。序列测定结果显示 17例患者血清的HBV分离株的前C/C     

脾内注射法免疫小鼠制备抗—HBc单克隆抗体的研究

用基因工程菌产乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对 Balb/c 小鼠脾内多点注射法免疫,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下融合,用固相放射免疫分析法(SPRIA)筛选,成功地获得了2株抗-HBc 阳性的杂交瘤细胞株。通过中和试验和交叉鉴定,2株抗-HBc 单克隆抗体只能与 HBcAg 起反应,而不能与 HBsAg 和 HBeAg 反应。经多次亚克隆后,所得腹水中的抗-HBc 滴度达1:64000～1:28000。这2株单克隆抗体做包被抗体检测 HBcAg 和(125)~Ⅰ标记查患者血清标本时,所测得的结果与人抗-HBc 多克隆抗体做包被或(125)~Ⅰ标记所测得的结果相一致。2株杂交瘤细胞连续传代3个多月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的抗-HBc 单克隆抗体。     

血清HBsAg阴性和HBsAg阳性慢性活动性肝炎患者肝内HBV DNA的研究

用原位杂交法和ABG法对慢性活动性肝炎患者(以下称CAH)血清HBsAg阴性34例和阳性30例对比进行了肝内HBV DNA、HBcAg和HBsAg的检测。上述检出率在34例HBsAg阴性CAH者中分别为23.5％,23.5％和32.4％,30例HBsAg阳性者中分别为63.3％、56.7％和83.3％。结果表明,在我国,血清HBsAg阴性、HBV相关抗体阳性或阴性的CAH中,仍有少部分人肝内存在HBV DNA和HBV抗原表达,并与肝病发病机理有关。血清HBsAg阳性的CAH者中,无论血清HBeAg阳性,或抗HBe阳性、或HBeAg阴性,均有较高比例的肝内HBV DNA和HBV抗原检出。肝内HBcAg与肝内HBV DNA关系密切,可作为反映HBV活跃复制指标;肝内HBsAg则不然。     

HBcAg ELISA法测定的临床分析

目的研究ELISA法测定HB cAg在HBV感染者中的阳性检出率、分布规律及与其他乙肝标志物的关系,探讨其在反映HBV复制及传染性和观察疗效方面的临床价值。方法采用ELISA法对416例HBV感染者进行血清乙肝6项指标测定,按其不同阳性结果分9种模式对比分析。结果416例HBV感染者中HB cAg ELISA法测定阳性总检出率达56.7%,而70例未感染者及65例抗-HB s单项阳性者中无阳性检出。结论ELISA测定血清HB cAg在HBV感染者中的阳性检出具有特异性,并可作为疑有抗-HBe阳性“逆转”为HBeAg阳性者的筛选检测,对判断HBV复制程度、病程、疗效及预后评估均有临床价值。     

化疗栓塞联合冷冻对肝癌患者免疫功能的影响

目的：探讨肝动脉化疗栓塞（TACE）联合冷冻消融对中晚期肝癌患者免疫功能的影响及临床意义。方法：搜集59例中晚期原发性肝细胞癌（经影像学检查显示无远处转移）患者资料,依据接受治疗方式不同分为两组：TACE联合冷冻消融治疗组27例为研究组;单纯接受TACE 32例为对照组;研究组在TACE术后2～3周行冷冻消融术。两组分别于治疗前1周、治疗后1月取外周血,测定AFP、T淋巴细胞亚群（CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋/CD8^＋、Treg）水平变化;术后1个月采用增强CT、MRI评价肿瘤坏死程度。结果：两组治疗后甲胎蛋白（AFP）均下降,差异均具有统计学意义（P〈0.01）。研究组肿瘤坏死率（53.9%）较对照组（32.8%）高,差异具有统计学意义（P〈0.01）。研究组调节T细胞（Treg细胞）比例由（8.43±2.58）%下降至（7.33±2.56）%,治疗前后差异具有统计学意义（P〈0.01）;CD3^＋、CD4^＋细胞比例及CD4^＋/CD8^＋分别由（49.07±6.59）%、（46.51±8.17）%、1.23±0.32上升至（52.16±6.44）%、（50.63±8.27）%、1.52±0.46,治疗前后差异均具有统计学意义（P〈0.01）;CD8^＋由（39.15±6.54）%下降至（34.79±6.16）%,治疗前后差异具统计学意义（P〈0.01）。对照组治疗后Treg细胞、CD8^＋比例略有增加,CD4^＋细胞比例及CD4^＋/CD8^＋略有下降,但治疗前后差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：TACE联合冷冻消融治疗中晚期肝癌能提高肿瘤坏死率,降低Treg细胞比例,改善患者细胞免疫抑制状态,增强机体的抗肿瘤免疫效应。     

电化学发光免疫分析检测乙肝标志物的临床价值

目的探讨电化学发光免疫分析（ECLIA）定量检测乙肝标志物的临床意义。方法采用ECLIA法定量检测361例乙肝患者的HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc水平,分析其与HBV-DNA水平、肝功能检测结果、临床分型的相关性。结果HBsAg、HBeAg与HBV-DNA定量呈正相关（r=0．6336,0．4032,P〈0．01）,HBsAb、HBeAb、HBcAb与HBV．DNA定量呈负相关（r=-0．2582,-0．3864、-0．3568,P〈0．01）;乙肝标志物定量检测与患者肝功能指标均无相关性（P〉0．05）;HBsAg、HBeAg、抗-HBc含量在急性乙肝和亚急性重症乙肝患者中较慢性乙肝、慢性重型乙肝和肝硬化患者低（P〈0．05）。结论ECLIA定量检测乙肝病毒血清学标志物含量可反映乙肝病毒的复制水平,定量检测结果与肝功能异常无明显关联,但与临床分型相关。     

华蟾素联合化学药物经动脉灌注栓塞治疗原发性肝癌的价值探讨

目的探讨华蟾素联合化学药物经动脉灌注栓塞(TACE)治疗原发性肝癌的临床价值。方法144例HbsAg阳性肝癌患者,A组76例采用动脉灌注(TAI)华蟾素100 m l、顺铂、5-氟脲嘧啶及阿霉素碘化油乳剂栓塞(TAE);B组68例采用顺铂、5-氟脲嘧啶及阿霉素碘化油乳剂动脉灌注栓塞(TACE)。结果A组有效率(PR+MR)86.84%,淋巴细胞转化率(LTT)、T细胞亚群CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比值上升,血清HBV DNA 21例下降、46例不变、9例上升,而外周血白细胞计数无显著变化;1、2年生存率分别为86.84%(66/76)和71.05%(54/76);B组有效率(PR+MR)72.73%,LTT、T细胞亚群CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比值下降,血清HBV DNA 2例下降、20例不变、46例上升,外周血白细胞计数下降;1、2年生存率分别72.73%(48/68)和54.41%(37/68)。2组近期有效率、T细胞亚群变化、HBV DNA变化及生存率的差异均有显著意义。结论应用华蟾素联合化学药物经动脉灌注栓塞治疗原发性肝癌,对改善患者生存质量及提高生存期有重要价值。     

射频消融亚致死性温度对肝癌干细胞的影响

目的 研究亚致死温度射频消融(RFA)对肝癌干细胞(LCSC)产生及其相关转录因子表达的影响.方法 利用小鼠Hep1-6肝癌细胞株和肝细胞癌(HCC)患者临床样品,检测LCSC相关标志物和转录因子的表达.结果 不同温度分别刺激Hep1-6细胞后发现,45℃是不能诱导细胞死亡的亚致死性温度.流式细胞仪(FCM)检测显示45℃处理可引起CD13+、CD44+、CD90+、CD133+ Hep1-6细胞水平明显上调,提示45℃温度导致Hep1-6细胞中以上各型LCSC产生增加;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测显示45℃温度导致CD13、CD90、CD133 mRNA水平明显上调.CD13 mRNA水平在5例HCC患者复发肝癌组织中均明显上调,CD133 mRNA在4例复发肝癌中上调,CD90 mRNA仅在1例复发肝癌中上调;FCM检测显示CD13+ LCSC水平在4例复发肝癌中明显上调,CD133+ LCSC水平仅在1例复发肝癌中上调,提示CD13+ LCSC水平上调与45℃温度关系更密切.RT-qPCR检测显示4例CD13+ LCSC上调的复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中Sox2、Stat1明显上调,FCM检测显示45℃处理Hep1-6细胞后Sox2、Stat1 mRNA明显上调.用Sox2、Stat1 siRNA分别沉默了Sox2、Stat1基因,表明Sox2 、Stat1均参与了45℃温度诱导的CD13+ LCSC产生.结论 RFA治疗中45℃亚致死性温度所致CD13+ LCSC水平增高与Sox2、Stat1表达有关.该结果对肝癌复发研究有一定借鉴意义.     

乙型肝炎患者肝内HBV抗原表达与肝细胞病变的关系

本文用ABC法和单克隆抗体检测139例乙肝患者肝组织内HBsAg和HBcAg。HBcAg阳性89例(64.0％),阳性率随乙肝病变严重程度依次递增,膜型HBsAg可能与疾病严重程度有关。HBcAg阳性68例(48.9％),阳性率以慢活肝最高而HBsAg携带者最低,浆膜型HBcAg可能反映了疾病的活动性。HBsAg和HBcAg的膜表达可能与乙肝肝细胞病变密切相关。     

高压氧辅助治疗对胃癌根治术后患者胃肠激素及免疫因子的影响

目的探讨腹腔镜根治术后应用高压氧(HBO)治疗对胃癌患者胃肠激素及免疫功能的影响。方法选择2018年5月至2019年12月山西省长治医学院附属和平医院收治的82例腹腔镜胃癌根治术患者,采用随机数字表法分为观察组及对照组,每组41例。2组患者均行腹腔镜胃癌根治术,观察组术后行HBO治疗。比较2组患者手术时间、术中出血量、排气时间及住院时间;比较2组患者术前1 d、术后第6天血清胃肠激素(胃动素、胃泌素)及T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平。结果观察组患者术后排气时间及住院时间均短于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);2组患者术后第6天血清胃动素、胃泌素水平较术前1 d明显降低,且观察组治疗后胃动素、胃泌素水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);术后第6天,2组患者血清CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平较术前1 d明显下降,CD8+水平较术前1 d明显升高,且观察组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于对照组(P<0.05),但2组患者术后第6天CD8+水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔镜胃癌根治术后采用HBO治疗,可缩短患者术后排气时间与住院时间,促进术后胃肠激素的分泌与免疫功能的恢复。     

乙型肝炎血清前S1抗原与HBV-DNA和HBeAg相关性分析

目的探讨乙型肝炎血清前S1抗原(PreS1Ag)临床应用的价值。方法对365例乙型肝炎患者血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标志物和PreS1Ag,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测HBV-DNA。结果 HBV-DNA和PreS1Ag的阳性率在110例HBV大三阳中,分别为86.4%和89.1%;在66例HBV小三阳中,分别为36.4%和40.9%;在37例HBsAg、HBcAb中,分别为32.4%和41.7%;在39例HBeAg、HBcAb阳性中,分别为15.4%和15.4%;在113例HBsAb阳性中,分别为5.3%和8.0%。HBeAg、PreS1Ag阳性率随不同载量HBV-DNA升高而增高,但PreS1Ag比HBeAg增高更明显(P<0.05)。结论 PreS1Ag和HBV-DNA一样都是乙型肝炎病毒复制的敏感指标,虽然PreS1Ag和HBeAg都随HBV-DNA载量增加而升高,但PreS1Ag较HBeAg更能敏感,因此PreS1Ag具有重要的临床应用价值。