美法仑体内的抗肿瘤作用与IFN-γ的关系

目的:探讨单一剂量的美法仑对荷瘤野生型C57BL/6小鼠的疗效与IFNγ的关系。方法:以3种遗传背景相同、基因型不同的IFNγ / 、IFNγ /-和IFNγ-/-C57BL/6小鼠为模型,皮下接种数量相同的小鼠淋巴瘤EL4细胞。接种瘤细胞后12d,给基因型不同的各组荷瘤小鼠腹腔内单次注射7.5mg/kg的美法仑。以野生型C57BL/6荷瘤小鼠(IFNγ / )为对照,观察美法仑对IFNγ /-C57BL/6荷瘤小鼠和IFNγ-/-C57BL/6荷瘤小鼠的治疗效应。结果:7.5mg/kg的美法仑单次腹腔内注射治疗后,可使IFNγ / 和IFNγ /-C57BL/6小鼠的肿瘤完全消退并治愈,而对IFNγ-/-荷瘤C57BL/6小鼠无治疗作用。结论:IFNγ与美法仑化疗的效果密切相关,即美法仑的抗肿瘤作用需要IFNγ参与。     

化疗治愈荷瘤小鼠模型的建立及氟尿嘧啶抑瘤作用的免疫机制

目的:建立荷瘤野生型C57BL/6小鼠及C57BL/6裸鼠模型,探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)抑瘤作用的免疫机制。方法:给正常野生型C57BL/6小鼠皮下接种小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立荷EL4肿瘤的小鼠模型。接种瘤细胞后12d,荷瘤小鼠腹腔单次注射不同剂量的5-FU,找出5-FU可发挥最大的抑瘤作用、并能致使荷瘤小鼠肿瘤消退不再复发的最小使用剂量。遗传背景相同的野生型C57BL/6小鼠及C57BL/6裸鼠同时皮下接种小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立两种荷瘤小鼠模型。接种瘤细胞后12d,两种荷瘤小鼠腹腔内同时注射可使野生型C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤消退不再复发5-FU的最低剂量,以正常野生型C57BL/6小鼠为对照,观察5-FU对T淋巴细胞缺陷裸鼠的抑瘤作用。结果:以75mg/kg5-FU治疗1周后,两种荷瘤小鼠的肿瘤以相同的速率缩小直至消失。但在5-FU治疗2周后,T淋巴细胞缺陷的C57BL/6裸鼠肿瘤复发,而免疫功能正常的野生型C57BL/6小鼠肿瘤治愈。结论:单一剂量的5-FU对荷淋巴瘤EL4小鼠具有明显的近期治疗效果,5-FU抑瘤作用的发挥不需要T细胞参与;但5-FU抗肿瘤作用的远期疗效与机体T淋巴细胞功能密切相关。     

美法仑治愈荷瘤小鼠的过程与TNFα的关系

目的探讨单一剂量的美法仑治愈荷瘤野生型C57BL/6小鼠的过程与肿瘤坏死因子α(TNFα)的关系。方法以3种遗传背景相同、肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因型不同的TNFR1 / 、TNFR1 /-和TNFR1-/-C57BL/6小鼠为实验动物,皮下接种数量相同的小鼠淋巴瘤EL4细胞。接种瘤细胞后12d,给基因型不同的各组荷瘤小鼠腹腔内单次注射7.5mg/kg的美法仑。以荷瘤野生型C57BL/6小鼠(TNFR1 / )为对照,观察美法仑对荷瘤TNFR1 /-C57BL/6小鼠和荷瘤TNFR1-/-C57BL/6小鼠的治疗效应。结果在美法仑(7.5mg/kg)治疗后的1周内,基因型不同的各组荷瘤小鼠肿瘤消退的速度基本相同。在随后的2月内,荷瘤TNFR1 / 和TNFR1 /-C57BL/6小鼠的肿瘤结节逐渐消退、肿瘤治愈;而多数荷瘤TNFR1-/-C57BL/6小鼠的肿瘤结节缩小后又再次出现并逐渐长大、肿瘤复发。结论TNFα与美法仑治愈肿瘤的过程密切相关,其中美法仑的抗肿瘤作用与荷瘤小鼠TNFR1的表达无关,但在美法仑治疗后,机体预防或避免肿瘤复发方面需要TNFR1在机体细胞的表达,而不是在肿瘤细胞的表达。     

小剂量美法仑治愈荷瘤小鼠过程中外周血细胞计数的变化及其意义

目的: 观察在小剂量美法仑治愈荷瘤C57BL/6小鼠过程中外周血细胞计数的变化与肿瘤结节缩小之间的关系, 为进一步研究化疗治愈肿瘤的作用机制奠定基础.方法: 野生型C57BL/6小鼠皮下接种小鼠淋巴瘤EL4 细胞, 建立荷EL4 肿瘤的小鼠模型.肿瘤接种后12 d, 12只荷瘤小鼠随机分成2组, 7.5 mg/kg美法仑单次腹腔内注射, 等量生理盐水对照.观察荷瘤小鼠肿瘤结节直径的变化.用药组小鼠分别在7.5 mg/kg美法仑治疗前3 d、治疗后6 h、治疗后第4、 7、 11、 15、 28天内眦静脉取血, 进行血常规检测, 分析荷瘤小鼠外周血象与荷瘤小鼠肿瘤结节缩小之间的相关性.结果: 7.5 mg/kg美法仑治疗后, 荷瘤小鼠肿瘤消退;而对照组荷瘤小鼠肿瘤继续生长.美法仑治疗后6 h外周血白细胞为(10.6±2.3)×109/L, 与治疗前(9.8±0.32)×109/L比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后第4天外周血白细胞降为(2.9±0.97)×109/L, 与治疗前比较差异具统计学意义(P<0.01), 随后尽管白细胞数有所回升, 但在治疗后第28天仍明显低于化疗前水平(P<0.01).Hb含量在美法仑治疗后6 h由化疗前的(132±7) g/L降为(110±14) g/L(P<0.05), 随后Hb含量持续降低, 治疗后第7天达最低点(96±5) g/L, 以后逐渐升高, 治疗后15 d恢复至化疗前水平.用药后6 h荷瘤小鼠血小板计数升至(1502±142)×109/L, 与用药前(914±322)×109/L比较差异具有统计学意义(P<0.01), 随后1周内一直维持在高水平, 治疗后第11天血小板恢复至化疗前水平.结论: 美法仑在使荷瘤小鼠的肿瘤结节缩小的同时可引起外周血白细胞数和血红蛋白浓度的降低, 但对血小板无抑制作用.美法仑化疗后1周内血小板计数的增加可能与美法仑的抗肿瘤作用有关.     

γ-干扰素在小剂量美法仑治愈肿瘤过程中对荷瘤小鼠外周血血小板计数的影响及其意义

目的:探讨γ-干扰素(IFN-γ)在小剂量美法仑治愈肿瘤过程中对荷瘤小鼠外周血血小板(PLT)计数的影响及其意义.方法:利用单一剂量美法仑治愈荷瘤野生型C57BL/6小鼠模型, 取遗传背景相同、基因型不同的IFN-γ+/- 和IFN-γ-/- C57BL/6小鼠各6只, 观察7.5 mg/kg美法仑治疗后两组荷瘤小鼠肿瘤结节直径的变化, 并且分别在美法仑用药前第3天、用药后6 h、用药后第4、 7、 11、 15、 28天内眦静脉取血, 肝素抗凝后进行血常规检测, 观察两组荷瘤小鼠外周血PLT计数的动态变化并进行比较, 了解美法仑治疗后荷瘤小鼠化疗的疗效及其外周血PLT计数的变化与体内IFN-γ免疫功能之间的关系.结果:美法仑用药前两组荷瘤小鼠肿瘤结节的直径和外周血PLT计数比较差异无统计学意义(P>0.05).7.5 mg/kg美法仑用药后第1天, 两组荷瘤小鼠肿瘤结节缩小均不明显;用药后第4天, 荷瘤IFN-γ-/-小鼠肿瘤生长轻度受抑后进行性增大, 并在用药后2周内所有小鼠肿瘤复发、死亡, 而对照组IFN-γ+/- 小鼠肿瘤的肿瘤结节进行性缩小、肿瘤消退并治愈.7.5 mg/kg美法仑用药后6 h, 荷瘤IFN-γ+/- 小鼠外周血PLT计数较前明显升高, 达(1935±378)×109/L (P<0.01), 而荷瘤IFN-γ-/-小鼠外周血PLT计数较前无明显升高, 为(1183±186)×109/L (P>0.05), 两组数据比较差异具有统计学意义(P<0.01).美法仑用药1 d以后, 荷瘤IFN-γ+/- 小鼠外周血PLT计数较前逐渐下降, 用药后第11天降至(1158±270)×109/L, 恢复至化疗前水平(P>0.05);而荷瘤IFN-γ-/-小鼠外周血PLT计数一直维持在正常水平;两组荷瘤小鼠外周血PLT计数比较差异无统计学意义.结论:小剂量美法仑治疗荷瘤C57BL/6小鼠过程中, IFN-γ免疫功能正常的荷瘤IFN-γ+/-小鼠在用药后6 h出现外周血血小板计数的"一过性"增高, 小鼠肿瘤治愈;而IFN-γ免疫功能缺陷的荷瘤IFN-γ-/-小鼠在用药后6 h不出现外周血PLT计数的增加, 小鼠肿瘤复发死亡.提示在小剂量美法仑治愈肿瘤过程中荷瘤小鼠外周血PLT计数的升高与其体内IFN-γ的免疫功能密切相关.     

小鼠白介素—12基因转染对EL4细胞在小鼠体内成瘤性的抑制作用

目的探讨逆转录病毒(RV)载体介导的小鼠白介素12(mIL-12)融合基因转染,对低免疫原性的小鼠T细胞淋巴瘤细胞EL4体内生长的影响。方法用共培养法导入基因,以PCR法检测基因的导入。以脾细胞增殖法测定mIL-12的生物学活性。观察导入mIL-12基因的肿瘤细胞EL4/12于小鼠皮下接种后的成瘤性。对预先接种野生型肿瘤细胞EL4的小鼠,用60Co照射的肿瘤疫苗EL4/12接种于瘤周,观察瘤苗的抗肿瘤作用等。结果在EL4/12细胞中,用PCR可特异地检测到mIL-12p35和p40亚基的cDNA片段。5×105EL4/12细胞48h表达的mIL-12达(10.2±3.2)ng。EL4/12细胞在小鼠体内的成瘤性明显下降。EL4/12瘤苗治疗组约50%的小鼠可长期无瘤生存,而对照组小鼠则在短期内全部成瘤死亡。部分长期生存的小鼠产生了有效的抗肿瘤免疫,能耐受野生型肿瘤细胞的二次攻击。与对照组相比较,疫苗治疗组中其余小鼠的成瘤时间延迟(P∨0.01),小鼠存活时间延长(P∨0.01);死亡时肿瘤体积小(P∨0.05),形成的肿瘤有完整包膜,瘤周和肿瘤内部有较多的淋巴细胞和浆细胞浸润等。结论转染mIL-12基因能抑制EL4肿瘤细胞的成瘤性。mIL-12基因修饰的肿瘤疫苗对野生型肿瘤细胞具有治疗作用。     

构建海人酸诱导的内侧颞叶癫痫小鼠模型

目的 建立C57BL/6颞叶癫痫小鼠模型,观察其在行为学和病理学上的变化.方法 将C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、0.9%氯化钠注射组(35μL/g)和海人酸注射组(12 mg/kg),进行单侧海马注射.注射5 d或5周后,取小鼠脑进行HE染色,观察海马病理结构改变;检测海马组织中mTOR通路标志物P-S6蛋白质...     

小鼠白介素-12基因转染对EL细胞在小鼠体内成瘤性的抑制作用

目的探讨逆转录病毒(RV)载体介导的小鼠白介素12(mIL-12)融合基因转染,对低免疫原性的小鼠T细胞淋巴瘤细胞EL4体内生长的影响.方法用共培养法导入基因,以PCR法检测基因的导入.以脾细胞增殖法测定mIL-12的生物学活性.观察导入mIL-12基因的肿瘤细胞EL4/12于小鼠皮下接种后的成瘤性.对预先接种野生型肿瘤细胞EL4的小鼠,用60Co照射的肿瘤疫苗EL4/12接种于瘤周,观察瘤苗的抗肿瘤作用等.结果在EL4/12细胞中,用PCR可特异地检测到mIL-12p35和P40亚基的cDNA片段.5×105EL4/12细胞48h表达的mIL-12达(10.2±3.2)ng.EL4/12细胞在小鼠体内的成瘤性明显下降.EL4/12瘤苗治疗组约50%的小鼠可长期无瘤生存,而对照组小鼠则在短期内全部成瘤死亡.部分长期生存的小鼠产生了有效的抗肿瘤免疫,能耐受野生型肿瘤细胞的二次攻击.与对照组相比较,疫苗治疗组中其余小鼠的成瘤时间延迟(P＜0.01),小鼠存活时间延长(P＜0.01);死亡时肿瘤体积小(P＜0.05),形成的肿瘤有完整包膜,瘤周和肿瘤内部有较多的淋巴细胞和浆细胞浸润等.结论转染mIL-12基因能抑制EL4肿瘤细胞的成瘤性.mIL-12基因修饰的肿瘤疫苗对野生型肿瘤细胞具有治疗作用.     

肺痹方干预肺纤维化模型小鼠细胞外基质转化的机制

背景:肺组织损伤修复过程中,细胞外基质成分首先填补损伤肺组织,当其过度沉积时可形成肺间质纤维化。目的:探讨肺痹方对博莱霉素致肺纤维化小鼠细胞外基质转化的干预作用。方法:将60只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方低剂量组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组,每组10只。除空白对照组外,其余5组腹腔注射博莱霉素[7.5 mg/(kg·d)]建立肺纤维化模型,连续注射10 d。造模后第1天各药物组灌胃给药[51.43 mg/(kg·d)]吡非尼酮,[6.43,12.86,25.72 mg/(kg·d)肺痹方],连续给药28 d。用药28 d后取肺组织,采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察小鼠肺组织的形态学变化,ELISA法检测血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平,Western blot法检测肺组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达。结果与结论:①与空白对照组相比,各组小鼠血清转化生长因子β1水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组血清转化生长因子β1水平显著降低(P<0.05,P<0.01),肺痹方高剂量组降低最明显;②与模型组相比,用药各组血清肿瘤坏死因子α水平明显降低(P<0.01),用药各组之间两两比较差异无显著性意义(P>0.05);③与空白对照组相比,各组α-平滑肌肌动蛋白表达均不同程度增高(P<0.05,P<0.01);肺痹方高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达低于肺痹方低、中剂量组,差异有显著性意义(P<0.05);④与空白对照组相比,模型组、肺痹方低剂量组Ⅰ型胶原表达增高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,肺痹方中、高剂量组Ⅰ型胶原表达降低(P<0.05);⑤与空白对照组相比,各组Ⅲ型胶原表达均不同程度增高(P<0.05,P<0.01);肺痹方中、高剂量组以及吡非尼酮组Ⅲ型胶原表达明显低于肺痹方低剂量组(P<0.05,P<0.01);⑥结果表明,肺痹方可以减轻肺纤维化,抑制博来霉素诱导的肺纤维化小鼠细胞外基质转化,其机制可能与下调血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平,抑制肺组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达有关。     

NF-E2相关因子2对糖尿病模型小鼠视网膜内细胞及血管的保护作用

目的 探讨NF-E2相关因子2（Nrf2）对糖尿病视网膜细胞及血管的保护作用。方法 8周龄雄性Nrf2^+/+（野生型）和Nrf2^-/- C57BL/6小鼠60只随机分为模型组和对照组,共4组,每组各15只。模型组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ,45mg/kg）,连续注射5 d;对照组小鼠注射同体积的枸橼酸缓冲液。模型组和对照组小鼠初次注射后每周测空腹血糖及体重,至第10周取视网膜。采用免疫印迹法检测视网膜内Nrf2激活的下游蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）的表达情况;免疫荧光染色检测具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）阳性的视网膜节细胞（RGCs）及胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性的无长突细胞（ACs）并计数;采用过碘酸-希夫和苏木素染色,观察视网膜内无细胞毛细血管并进行定量分析。 结果 STZ诱导1周后,野生型和Nrf2^-/-模型组小鼠血糖急剧升高,体重开始显著下降,随着周龄的增长体重无明显增加;对照组小鼠血糖值无明显升高,体重呈正常缓慢增长趋势。STZ诱导糖尿病10周后,RBPMS和ChAT染色发现,Nrf2^-/-糖尿病小鼠视网膜内RGCs和ACs数量显著降低（P<0.05）;过碘酸 希夫和苏木素染色显示,Nrf2^-/-糖尿病小鼠视网膜内出现无细胞毛细血管;免疫印迹法显示,野生型小鼠模型组中Nrf2激活的下游蛋白HO-1表达升高。 结论 Nrf2对糖尿病视网膜细胞及血管具有保护作用,其可能是通过诱导HO-1上调发挥作用。     

小鼠脊髓前角运动神经元的分离、培养和鉴定

目的:探讨一种分离小鼠脊髓前角运动神经元的方法,为运动神经元相关的研究提供依据。方法:分离13 d的C57BL/6胎鼠脊髓,利用Optiprep分离液经密度梯度离心获得脊髓前角运动神经元,培养后观察神经元细胞形态的变化,免疫荧光双标法对分离运动神经元的纯度进行判定。结果:将分离到的运动神经元进行培养,能够观察到典型的神经元细胞形态及轴突生长。免疫荧光双标证明培养的细胞为运动神经元细胞,纯度约95%。结论:Optiprep分离液用于小鼠运动神经元的分离,可获得良好的分选效果。Optiprep分离液可用于运动神经元相关的研究。     

The pathological effect of Helicobacter pylori infection on liver tissues in mice

Helicobacter pylori infection is associated with chronic gastritis, peptic ulcer, gastric adenocarcinoma, and mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. Some reports also suggest that it causes extragastric disease, including hepatitis. In this study, the pathological changes in the liver and gall bladder in H. pylori -colonized C57BL/6 mice were investigated. Twenty mice were inoculated orally with H. pylori strain SS1, and ten controls were injected with phosphate-buffered saline. Gastric colonization with H. pylori was assessed at 2 months after inoculation. Mice were examined at 8 months by histopathology, culture for H. pylori , and PCR for specific H. pylori genes. All C57BL/6 mice infected with H. pylori for 8 months developed severe gastric mucosal inflammation. Three mice showed mild-to-moderate mutifocal hepatitis. The gall bladder mucosa of one H.  pylori -infected mouse showed thickening of the mucous membrane with mild submucosal lymphocytic infiltration. H. pylori was observed morphologically in four liver specimens and six gall bladders from infected mice by immunohistochemistry. Specific H. pylori genes were also detected in six liver samples from infected mice, six samples of bile, and two blood samples by nested PCR. Thus, H. pylori inoculated orally may reach the hepatobiliary system and cause inflammation as an independent aetiological factor. The pathway to the liver may be via the blood or the biliary system.     

汉坦病毒感染C57BL/6小鼠组织中特异性抗原的检测

目的通过检测汉坦病毒感染C57BL/6小鼠组织中特异性病毒抗原,以建立汉坦病毒感染动物的评价体系。方法将汉坦病毒陈株按照原病毒液、10-1、10-2三个滴度经肌肉注射感染C57BL/6小鼠,在感染后的第3、6、9、12、15天,分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等组织研磨后制成病毒悬液,以ELISA法检测各组织中的病毒特异性抗原。结果 C57BL/6小鼠感染汉坦病毒后短期内在其肝脏和脾脏可以检测到特异性抗原,随着时间的延长,这些抗原逐步消失。结论上述结果为建立汉坦病毒感染动物的评价体系提供了一种参考。     

A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain

Strains of mice, through breeding or the disruption of normal genetic pathways, are widely used to model human diseases. Atlases are an invaluable aid in understanding the impact of such manipulations by providing a standard for comparison. We have developed a digital atlas of the adult C57BL/6J mouse brain as a comprehensive framework for storing and accessing the myriad types of information about the mouse brain. Our implementation was constructed using several different imaging techniques: magnetic resonance microscopy, blockface imaging, classical histology and immunohistochemistry. Along with raw and annotated images, it contains database management systems and a set of tools for comparing information from different techniques. The framework allows facile correlation of results from different animals, investigators or laboratories by establishing a canonical representation of the mouse brain and providing the tools for the insertion of independent data into the same space as the atlas. This tool will aid in managing the increasingly complex and voluminous amounts of information about the mammalian brain. It provides a framework that encompasses genetic information in the context of anatomical imaging and holds tremendous promise for producing new insights into the relationship between genotype and phenotype. We describe a suite of tools that enables the independent entry of other types of data, facile retrieval of information and straightforward display of images. Thus, the atlas becomes a framework for managing complex genetic and epigenetic information about the mouse brain. The atlas and associated tools may be accessed at http://www.loni.ucla.edu/MAP.     

联合阻断CD28/B7和ICOS对同种异体C57BL/6小鼠皮肤移植的影响

目的探讨CD28/B7共刺激通路阻断剂和ICOS/ICOSL共刺激通路阻断剂对同种异体小鼠皮肤移植的影响。方法实验动物随机分为4组,每组6只,供体、受体均为C57BL/6。CTLA4Ig处理组;ICOSIg处理组;CTLA4Ig+ICOSIg处理组;空白对照组。将C57BL/6小鼠背部全层皮肤移植于同种小鼠中段背部。前3组分别以150mg/kg的抗体经腹腔注射,空白对照组只注射同等量的生理盐水,注射时间为皮肤移植后0、2、4d,术后观察皮肤存活情况。术后6d分别处死各组受体鼠和供体鼠,取受体脾脏淋巴细胞与供体脾脏淋巴细胞作混合淋巴细胞反应(MLR),用MTT法测定细胞活力和细胞增殖反应。术后7d切取皮肤移植物作组织学分析。结果与对照组相比,各阻断剂单独治疗组能明显延长移植物的存活时间(<0.05),各阻断剂治疗组淋巴细胞对供体淋巴细胞产生特异性低反应(<0.05),能有效抑制淋巴细胞对同种抗原的免疫应答。组织学检查发现,各抗体治疗组移植皮肤结构基本正常。结论 CTLA4Ig、ICOSIg可以抑制免疫应答,诱导移植皮肤发生免疫耐受,延长存活时间。     

Knockout血清替代品可提高C57BL/6J小鼠胚胎干细胞建系效率

目的:在培养液中添加knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)代替胎牛血清(FBS)用于建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞(ESC)细胞系,以便消除血清中的不确定因子对ESC增殖的影响。方法:以C57BL/6J小鼠3.5 d的囊胚为材料分离ESC,比较KSR和FBS用于建立小鼠ESC细胞系的效率,并通过体内、外分化验证所分离获得的小鼠ESC的发育潜能。结果:培养液中添加KSR,成功从13个小鼠囊胚中分离获得一个ESC细胞系(MES-1),体外培养传代超过20代仍保持未分化状态,核型为正常XX型,碱性磷酸酶及oct-4基因高表达,悬浮培养可以生成拟胚体,接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤,注射到ICR小鼠3.5 d囊胚中,ESC可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。而培养液中添加FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。结论:在培养液中添加KSR代替FBS适合于C57BL/6J小鼠ESC的分离与培养,从而可避免实验前对所用血清的筛选。