大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

小鼠肝脏原位持续灌流方法的建立及其在肝脏非实质细胞分离中的应用

目的建立一种小鼠肝脏原位持续灌流的方法,并将该法应用于肝脏非实质细胞的分离。方法利用三通管和静脉留置针将门静脉、蠕动泵软管以及下腔静脉连接形成封闭回路,自门静脉端注入37℃的胶原酶消化液约60 ml,调节蠕动泵转速为20 ml.min-1行循环灌注约30 min,摘除肝脏剪切成小块组织,加入胶原酶孵育液消化30 min后碾碎制备成细胞悬液,离心后取沉淀先后以50%和35%的Per-coll密度离心即可获得小鼠肝非实质细胞。结果肝脏非实质细胞的得率为0.5×107～1×107个/鼠肝,流式检测CD45+细胞占(27.21±1.47)%。结论胶原酶肝脏原位持续灌流+体外孵育消化结合Percoll密度离心是分离小鼠肝脏非实质细胞的可靠方法。     

山莨菪碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的：研究山莨菪碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响，为应用山莨菪碱防治肝纤维化提供实验依据。方法：采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌流，以Nycodenz为分离介质，单层一步密度梯度离心法．分离大鼠的肝星状细胞。并以MTT比色法观察山莨菪碱对肝星状细胞的增殖效应．用流式细胞仪检测了肝星状细胞在细胞周期中DNA含量的改变。结果：山莨菪碱能明显抑制细胞增殖，并呈药物浓度依赖关系，DNA合成受到抑制。结论：山莨菪碱在体外具有抗肝纤维化的作用，它对于防治肝纤维化可能有一定的临床意义和应用前景。     

猪肝脏体外不同灌流系统建立和评价

目的：探讨体外肝脏灌流系统中的影响因素，建立稳定有效的体外肝脏灌流系统。方法：根据灌流和氧合的方式建立不同的体外猪肝脏灌流系统，随机分为3组(每组n=4)。A组单独灌流门静脉，氧合灌流液；B组同时灌流门静脉和肝动脉，共同氧合门静脉和肝动脉的灌流液；C组同时灌流门静脉和肝动脉，分别氧合门静脉和肝动脉的灌流液。观察体外肝脏灌流时间、胆汁分泌量、病理变化和血液动力学等指标。结果：A组的灌流时间明显低于B组和C组。在1，3，6h的时间点A组胆汁分泌量、血液动力学等指标和B、C组比较差异有统计学意义。在12h时间点B组和C组胆汁分泌量和血液动力学的差异也有统计学意义。结论：同时灌流门静脉和肝动脉，分别氧合门静脉和肝动脉灌流液的灌流系统更稳定，对体外肝脏功能的维持效果较好。     

人脐带沃顿胶间充质干细胞体外分离条件的优化及传代效应的流式细胞学检测

目的观察不同胶原酶消化方法对人脐带沃顿胶间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)分离和培养结果的影响,并鉴定其分化潜能;探讨传代效应对其免疫表型的影响。方法将制备好的脐带标本分别加入Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型胶原酶,持续消化4~18 h,筛网过滤,离心收集细胞,用DMEM/F12培养基重悬细胞,调整细胞密度4.8×103~1×104/cm2,接种培养,比较不同消化法分离人脐带沃顿胶MSC的效果。Von kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定人脐带沃顿胶MSC向成骨方向分化的能力,RT-PCR鉴定其向心肌细胞分化的能力。应用流式细胞仪检测连续传代后MSC的免疫表型变化。结果Ⅰ型胶原酶消化法能够从人脐带沃顿胶获取了数量较多、活力较高的MSC,而且细胞出现伸展的时间及原代培养时间均短于Ⅱ型胶原酶及Ⅳ型胶原酶消化法。表面标记分析显示:随着传代次数的增加,阳性标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105的表达百分率没有变化,而阴性标记CD31、CD34和HLA-DR的表达率增加明显。体外诱导实验表明:来源于人脐带沃顿胶的MSC具有体外成骨和成心肌样细胞分化的能力。结论Ⅰ型胶原酶消化法简单易行,对细胞损伤小,能稳定、高效地从人脐带沃顿胶中分离出MSC。     

山莨菪碱对肝纤维化发生的抑制作用

目的：肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化的形成和发展的核心环节，本实验研究山莨菪碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响，为应用山莨菪碱防治肝纤维化提供实验依据。方法：采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌流，以Nycodenz为分离介质，分离大鼠的肝星状细胞，并以MTT比色法观察山莨菪碱对肝星状细胞的增殖效应，用流式细胞仪检测肝星状细胞在细胞周期中DNA含量的改变。结果：山莨菪碱明显抑制肝星状细胞增殖，DNA合成受到抑制。结论：山莨菪碱具有抗肝纤维化的作用。     

夹层胶原"三明治"法短期体外培养肝细胞

目的研究胶原、表皮生长因子对新鲜分离SD大鼠肝细胞活率、形态和功能的影响。方法采用胶原酶二步原位循环肝脏灌注法分离SD大鼠肝细胞,测定不同条件培养后各组肝细胞的活性及功能。结果双层胶原及双层胶原 表皮生长因子组培养后细胞活性、细胞DNA含量及细胞功能均优于普通培养组(P＜0．05)。结论双层胶原体外培养体系提供了稳定的三维立体生长环境,有利于细胞在体外长期保存。     

体外培养的成肌细胞间隙连接蛋白43的表达及变化

为探索成肌细胞增殖分化时间隙连接蛋白(connexin)43的表达和变化，建立乳鼠成肌细胞体外培养，采用0．1％胶原酶消化法分离细胞及非连续密度梯度离心法纯化细胞，以电镜及免疫组织化学法鉴定成肌细胞；采用Western blot法检测分化过程中connexin 43的变化。结果表明，成肌细胞体外培养可以表达connexin 43，但随着细胞的融合分化，其表达量下降。结论：体外培养的成肌细胞间隙连接蛋白表达减少可能影响该细胞作为种子细胞进行心脏移植的效果。     

大鼠膀胱移行上皮细胞体外培养

采用Ⅳ型胶原酶消化大鼠膀胱粘膜上皮，可快速获得大量活性高的膀胱移行上皮细胞，细胞接种后1—2d贴壁生长，5—7d增殖明显，8—10d融合成片。培养的上皮细胞光镜下呈扁平多边形、单层排列：免疫组化显示95％以上的上皮细胞角蛋白抗体染色阳性；电镜下细胞表面可见大量微绒毛。大鼠膀胱移行上皮细胞的体外培养为细胞功能研究提供了有价值的模型。     

大鼠胰岛细胞原代培养模型的研究

目的：建立一种客观的用于糖尿病和降血糖药物研究的大鼠胰岛细胞原代培养模型。方法：大鼠胰腺经胶原酶消化后，利用细胞贴壁时间、紧密程度及存活时间的差异，获得较为纯净的胰岛细胞。通过胰岛素含量测定，葡萄糖刺激实验及移植实验评价该细胞的功能。结果：分离得到的胰岛细胞成活率可达95％以上；双硫腙染色表明大部分细胞团为含有β细胞的胰岛细胞团；经RPMI 1640培养的细胞，其上清及细胞内的胰岛素含量均高于DMEM组，且对葡萄糖刺激的敏感性优于DMEM组：培养的胰岛细胞移植入1型糖尿病模型小鼠体内，可使糖尿病小鼠的血糖降至正常。结论：利用该方法得到的胰岛细胞活力和纯度均较高，体外培养后细胞功能正常，有望成为一种实用的降糖药研究的细胞模型。     

四环素类化合物对膀胱癌EJ细胞增殖和金属酶活性的影响

目的：金属蛋白酶是降解细胞外基质的重要酶．最近有研究表明四环索族化合物有抑制金属蛋白酶活性和某些肿瘤细胞增殖的作用。但其对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的降解以及对人EJ细胞增殖作用影响尚不清楚。方法：用EJ细胞体外培养加入不同浓度的四环素和米诺环索．用MTT法测定其对EJ细胞的增殖作用的影响。EJ细胞体外培养后．加入不同浓度的四环索和米诺环索培养24h后再加入外源性的Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，继续培养24h．用放射免疫法测定培养液中的Ⅳ型胶原和层粘连蛋白含量。结果：四环索和米诺环索对层粘连蛋白的降解无明显影响．但两者均能阻止Ⅳ型胶原的降解．且相互间无显著性差异。四环素和米诺环对EJ细胞的增殖均无影响。结论：四环素和米诺环索均能抑制Ⅳ型胶原的降解．保护细胞外基质，这可能是由于两者络合Ca^2 或Zn^2 影响了Ⅳ型胶原酶的结构和活性。本实验发现四环素和米诺环索对层粘连蛋白的降解无明显影响．可能由于层粘连蛋白的降解有多种酶参与．如血浆纤维蛋白溶解酶等。米诺环素和四环索对EJ细胞增殖无明显影响．其原因可能是两者透过EJ细胞膜困难．不能影响细胞内线粒体内蛋白质合成。     

复方中药对肝星状细胞胶原合成与降解的影响

目的观察中药复方丹参对肝星状细胞胶原合成与降解的影响.方法选择肝星状细胞系作为体外研究对象,MTT法观察药物对细胞增殖的影响,ELISA法检测细胞上清液Ⅰ、Ⅲ、V型胶原含量,RNA-cDNA分子杂交检测细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGF β1 mRNA稳态水平.逆转录多聚酶链反应检测间质胶原酶及金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平.结果中药复方丹参明显抑制肝星状细胞增殖且呈剂量依赖趋势,与对照组比较,中药组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显降低,细胞内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及TGF β1 mRNA稳态水平明显降低,间质胶原酶基因表达水平明显增强,金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达水平明显受到抑制(P＜0.01).结论中药复方丹参可能通过抑制肝星状细胞的增殖,抑制胶原的异常合成,促进异常沉积胶原的降解,从而起到抗肝纤维化的作用.     

白介素-10对肝纤维化大鼠星状细胞表达细胞间黏附分子-1的影响

目的:探讨外源性白介素-10(IL-10)对肝纤维化大鼠星状细胞(HSC)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响.方法:60只♂性SD大鼠随机分为生理盐水对照组8只(N组)、CCl4组28只(C组)和IL-10干预组24只(Ⅰ组),建立正常对照、CCl4诱导肝纤维化模型及IL-10干预模型.造模第7周和第11周,采用链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶经门静脉离体灌流消化,11%Nycodenz密度梯度离心分离HSC.半定量RT-PCR法检测各组HSC的ICAM-1 mRNA表达水平.结果:成功构建纤维化大鼠模型并分离肝星状细胞.造模第7周、第11周新分离的HSC中,N组的ICAM-1不表达,C组与I组均检出ICAM-1表达,C组表达均明显高于Ⅰ组(P＜0.01);造模第11周,Ⅰ组的ICAM-1表达水平较第7周有明显下降(P＜0.01),C组较第7周则明显增多(P＜0.01).结论:ICAM-1随实验性大鼠肝纤维化进展表达升高;IL-10可通过抑制HSC ICAM-1表达,在抗纤维化中发挥作用.     

三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对肿瘤细胞Ⅳ型胶原酶的分泌及活性的影响

目的：植物来源的抗白血病药三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对肿瘤细胞增殖有显抑制，已成为急性粒细胞性自血病的首选药物之一：我们的研究还表明该药对肿瘤细胞的侵袭和运动也有明显抑制作用。为探讨其作用机理，进一步观察了该药对人纤维肉瘤HT-1080细胞Ⅳ型胶原酶的分泌及活性的影响。方法：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定HT-1080细胞Ⅳ型胶原酶MMP-2和MMP-9的产生及活性。结果：三尖杉酯碱在0．001，0．01μg/ml浓度下对HT-1080细胞MMP-2和MMP-9的产生及活性均无明显影响。     

雌、孕激素对子宫肌瘤细胞EGF表达的调节作用

目的：探讨孕酮、雌二醇对体外培养的子宫肌瘤细胞表皮生长因子（EGF）表达的调节作用。方法：用胶原酶消化分离肌瘤细胞进行培养，待细胞汇合成片时，分别加入3种浓度的孕酮和3种浓度的雌二醇，加药后3d用免疫细胞化学的方法检测各组细胞EGF蛋白表达的情况。结果：镜下观察肌瘤细胞呈梭形或不规则三角形，细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行；P4^-4组和E2^-5组肌瘤细胞与对照组相比生长较旺盛，相对细胞数量多、密度大。P4^-4组与对照组相比肌瘤细胞EGF蛋白的表达显著增加（P〈0．05）。结论：生理浓度的孕酮或雌二醇促进体外培养的子宫肌瘤细胞的增殖分裂；其中孕酮升调节体外培养的子宫肌瘤细胞EGF蛋白的表达。     

比较两种消化酶对分离大鼠肝细胞的影响

目的:比较胶原酶和胰蛋白酶在分离大鼠肝细胞数量、活力、原代培养及MTT试验等四个方面的差别。方法:分别用胶原酶和胰酶分离获取大鼠肝细胞,通过台盼蓝拒染试验测细胞活力并计数,将分离的肝细胞进行原代培养并观察肝细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)试验测肝细胞的增殖状况。结果:胶原酶分离的肝细胞数量是胰酶的2．4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2．8倍;胶原酶分离的肝细胞原代培养时贴壁慢,生长不良,而胰酶分离的肝细胞贴壁快,生长良好;MTT试验结果表明胰酶分离培养的细胞活性明显高于胶原酶。结论:胶原酶分离的细胞数量及纯度优于胰酶,而胰酶分离的细胞活力优于胶原酶。     

大鼠心室肌细胞急性酶分离及瞬时外向钾电流的记录

目的：探索成年SD大鼠心室肌细胞急性酶分离及记录瞬时外向钾电流的方法。方法以成年SD大鼠为研究对象,利用Langendorff灌流系统,利用Ⅱ型胶原酶二步灌流方法分离细胞,利用膜片钳技术记录大鼠心室肌瞬时外向钾电流。结果镜下可见存活心肌院呈杆状或矩形,表面干净,横纹清晰,立体感强,能记录出瞬时外向钾电流达3000 pA。结论本实验所用的方法细胞成活率高,能记录出瞬时外向钾电流。     

黄芪总提物对大鼠肝星状细胞增殖及产生胶原的影响

目的　研究黄芪总提物　（　TEA　）　对体外肝星状细胞增殖和产生胶原的影响　。方法　采用IV型胶原酶灌流分离大鼠肝星状细胞进行原代培养,　用CCl4急性损伤的大鼠肝枯否细胞条件培养基　（　KCCM　）　刺激肝星状细胞,　用3H-TdR和3H-Proline的掺入法分别检测肝星状细胞的增殖和胶原的产生　。结果　TEA(5～40　mg     

一氧化氮对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的影响

目的：研究一氧化氮(NO)对胰岛细胞分泌胰岛素的影响及其机制。方法：①采用经胰管注射胶原酶技术分离大鼠胰岛，葡聚糖(Ficoll)不连续密度梯度方法离心纯化胰岛；②用硝普钠(SNP)作为NO供体，硫酸亚铁(FeS04)作为NO抑制剂，放射免疫法检测胰岛细胞胰岛素分泌量。结果：NO明显抑制胰岛细胞胰岛素基础分泌和葡萄糖刺激的胰岛素释放，FeSO4能阻断这种作用(P值均＜0．05)。结论：NO能明显抑制大鼠胰岛细胞的分泌功能，这可能是体内胰岛细胞损害的因子之一。     

喉癌组织中Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白表达的临床意义

为探讨喉癌组织中Ⅳ型胶原（cⅣ）和纤维连接蛋白（FN）表达的临床意义，采用免疫组化法对57例喉癌组织中cⅣ和FN的表达情况进行了检测，结果表明，cⅣ的阳性率为43．9％（25／57）；FN的阳性率为73．7％（42／57）。淋巴结转移组cⅣ的阳性率（27．3％）明显低于非转移组（47．48％），P＜0．05；Ⅰ期cⅣ阳性率（66．7％）显高于Ⅳ期（38．9％），P＜0．05；Ⅳ期FN的阳性率（88．9％）显高于Ⅰ期（55．6％），P＜0．05。结论：cⅣ和FN是反映喉癌细胞浸润，转移等行为的较好指标，对了解病情，预测颈淋巴结转移有很大帮助。