两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

凋亡相关基因bcl-2和Bax在大鼠应激性溃疡中的表达及作用

目的筛选优化小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法以2条引物对4个品系的小鼠基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD-PCR,分析比较扩增结果。结果扩增结果较好的反应体系及扩增程序如下:在25 ml的反应体系中含有10×buffer2．5μl,dNTP 200 mmol／L,Mg2+ 2．5mmol／L,引物0．2 mmol/L,Taq酶1．25 U,扩增程序为94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸90 s,40个循环后72℃延伸5 min。结论这一反应体系和扩增程序在我们实验室得到了较好的扩增效果。     

香加皮ISSR—PCR条件体系的优化

采用正交设计法、均匀设计法,对影响香加皮IssR—PCR43体系的引物、Mg2＋、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度进行优化,通过两种方法的比较建立了适合香加皮ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,含Mg2＋1mmol／L、dNTP0．15mmol／L、引物1．0μmol／L、TaqDNA聚合酶1U、buffer2．5μL和模板DNA约50ng。在此基础上对扩增程序中的退火温度进行筛选,通过比较将退火温度定为50℃,最终扩增程序定为：94℃预变性4min接着进行40个循环：94℃变性30S,50~C退火1min,72℃2延伸90s;循环结束后72℃延伸10min。     

黄花蒿SRAP-PCR反应体系的建立与优化

目的用序列相关扩增多态性(SRAP)这一新的分子标记技术建立稳定可重复的黄花蒿Artemisia annua的SRAP最佳反应体系。方法以黄花蒿DNA为模板,分析了SRAP反应体系中的一些重要参数对PCR扩增的影响。结果建立了稳定可重复的SRAP反应体系;25μL反应体系中,模板DNA为30～105ng,MgCl2为2.0mmol/L,dNTP为0.25mmol/L,Taq酶为1.0U,引物为2.0μmol/L;扩增程序:94℃预变性3min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min。结论本研究建立的黄花蒿SRAP体系重复性好,稳定性强。     

中国地鼠RAPD分析体系的优化

目的　优化中国地鼠RAPD分析体系。方法　以30条引物对山医群体中国地鼠的两个家系基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD ,分析比较扩增结果。结果　在下列反应体系及温度循环参数下结果较好:在2 5 μl的反应体系中含有10×buffer 2 5 μl,dNTP 0 2mmol L ,Mg2 2 0mmol L ,引物0 2 μmol L ,Taq酶1 5U ,模板DNA 15ng ,扩增程序为94℃预变性3min后进入循环体系,94℃变性30s ,36℃退火5 0s ,72℃延伸1min ,4 0个循环后接7min延伸。结论　以上述反应体系及温度循环参数进行中国地鼠RAPD ,扩增结果稳定     

小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序的筛选

目的:筛选优化小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序.方法:以40条引物对9个品系的小鼠基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD-PCR,分析比较扩增结果.结果:在下列反应体系及扩增程序下结果较好:在25 μl的反应体系中含有10×buffer 2.5 μl,dNTP 200μmol/L, Mg2+ 2.5 mmol/L,引物0.2 μmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 20 ng,扩增程序为94℃变性1 min,38℃退火1 min,72℃延伸2 min,40个循环后接10 min延伸.结论:以上述反应体系及扩增程序进行小鼠RAPD-PCR,扩增结果稳定.     

黄花蒿ISSR-PCR反应体系的优化

目的:建立黄花蒿(Artemisia annuaL.)的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法:以黄花蒿DNA为材料,分析了ISSR反应体系中的DNA、Mg2 、dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为15~45 ng,2.5μL的10倍Buffer(Mg2 free)缓冲液,MgCl22.0 mmol/L,dNTPs为0.15 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物1.0μmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2 min,共计40个循环,循环结束后在72℃延伸5 min。结论:建立了适用于黄花蒿的ISSR反应体系,为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础。     

红景天属植物DALP反应体系的建立

目的 利用直接扩增片段长度多态(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的DALP反应体系。方法 以红景天基因组DNA为模板,对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果 建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系;经过大量重复性实验,反应体系为20μL,Mg2 浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为1.25 mmol/L,模板DNA的量为60 ng,5 pmol/L选择性引物1μL,5 pmol/L反向引物3 μL,引物浓度比为1:3,Taq酶2 U。反应过程为:95℃预变性5 min、94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min;30个循环,再72℃延伸10 min,完成整个PCR反应。结论 该体系可有效地应用于红景天属药材的分类鉴定和地道性鉴定。     

白芷ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的:建立白芷的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序.方法:以白芷基因组DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响.结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为10～30 ng,2.5μ10×PCR buffer(Mg2 free),MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.6 pμmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2min,共计39个循环,循环结束后在72℃延伸5 min.结论:建立了适用于白芷的ISSR反应体系.为今后利用ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础.     

人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

目的建立PCR—RAPD反应体系，提升细粒棘球蚴随机扩增多态性DNA（RAPD）遗传多态性研究的稳定性，为研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。方法采用改进的酚-氯仿抽提法提取细粒棘球蚴基因组DNA，用单因素筛选方法建立PCR—RAPD分析体系。结果采用改进的酚／氯仿抽提方法提取细粒棘球蚴基因组DNA质量高，适用于PCR—RAPD扩增分析；在25μL体系中，RAPD—PCR扩增反应各成分的最佳浓度为：dNTP0．2—0．3mmol／L、Taq酶2．5U、随机引物0．8—1．4μmol／L，模板为60ng。PCR扩增最佳条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s、32℃退火45s、72℃延伸1min、共35个循环；最后72℃延伸10min；初步从20条引物中筛选出11条带型丰富的随机引物。结论酚-氯仿适用于提取细粒棘球蚴基因组DNA，优化的RAPD反应体系和筛选出的随机引物适合进行细粒棘球蚴RAPD遗传多态性分析。     

微波照射对小白鼠DNA的影响

实验检测了微波照身地小白鼠核ＤＮＡ的影响及修复情况，结果表明照射后ＤＮＡ会产生单、双链断裂、双链缺口等损伤，睾丸组织ＤＮＡ最敏感，提示微波在计划生育的方面的有益应用。     

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的探讨过氧化氢(H2O2)导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶(COX)基因损伤(突变)后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系.方法采用生物信息学技术,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构,并利用已有的实验数据,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究.结果在COX Ⅰ的三维结构中突变的部位(残基297～306)位于分子的最外部,而该区域参与了与B亚基(相当于COXⅡ亚基)的作用,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响;COXⅡ突变后,组成分子结构的"椅靠"部分和"椅面"部分之间的夹角略有增大,而"椅靠"和"椅面"之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性.结论H2O2导致的mtDNA编码COX Ⅰ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变,这种改变是其功能改变(如酶蛋白活性下降)的主要原因.     

HBV-DNA阳性结果与乙肝血清标志物间的相互性分析

随着医疗技术的发展 ,临床实验室对乙型肝炎诊断的实验也日益增多 ,单一的试验结果已经远远不能满足现代临床诊断的需要及对病情预后、疗效的观察。为了探讨ＰＣＲ技术测定ＨＢＶ -ＤＮＡ的临床应用价值 ,本文对 12 0例ＨＢＶ -ＤＮＡ阳性的患者血清ＥＬＩＳＡ法测乙肝血清标志物 ,并且对试验结果进行了比较和分析。1　材料与方法1 1　标本 :血清来源于本院门诊和病房就诊者。1 2　仪器 :厦门Ａｍｐｌｌｙ生物工程有限公司Ｇｅｎｅｓｔａｒ 96 2 5型ＤＮＡ扩增仪。法国Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ公司Ｓｉｇｍａ 96 0型酶标仪。1 3　方法与试剂 :Ｐ…     

中药材DNA分子标记研究的技术问题Ⅰ.植物药基因组DNA的提取

随着DNA分子标记技术在中药中的广泛应用,快速有效地将材料中的DNA提取出来成为研究的关键步骤。综述了90年代以来文献报道的针对提取过程中出现的各种问题所采取的相应措施,主要涉及如何去除提取材料中的酚类和多糖类杂质。     

一种简单、高效的小分子量DNA沉淀法

沉淀是浓缩核酸最常用的方法。通过核酸沉淀可以改变核酸的溶解缓冲液 ,重新调节核酸在溶液中的浓度 ,还可以去除溶液中某些盐离子与杂质 ,达到纯化核酸的目的[1] 。　　大分子量核酸样品的沉淀方法很多 ,操作简单、效果比较好。而小分子量ＤＮＡ(特别 <5 0ｂｐ的寡聚核苷酸 )的沉淀方法往往依赖于高速或超速冷冻离心机 ,且操作步骤繁锁 ,一般实验室难以满足实验条件[2 ] 。本文介绍一种简单、有效的小分子量ＤＮＡ沉淀方法 ＺｎＣｌ2 沉淀法 ,具体操作步骤如下 :①准确测量ＤＮＡ样品的体积 ;②加入 0 .0 5倍ＤＮＡ样品体积的 1ｍｏｌ/Ｌ…     

胆囊收缩素cDNA探针制备及其在癫痫发病机制研究中的应用

①目的　制备胆囊收缩素（ Ｃ Ｃ Ｋ）ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,并以此探针检测遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达。②方法　将含０．５ｋｂｐ Ｒａｔ Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 的质粒 Ｐ Ｕ Ｃ１３ 扩增、回收和纯化,用随机引物标记法,得到地高辛精（ Ｄｉｇ）标记 Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针。用原位杂交技术,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达进行研究。③结果　 Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针标记效率为５０ｍ ｇ／ Ｌ;遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达显著增加。④结论　本实验制备的 Ｄｉｇ Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,具有较好的特异性和灵敏度;原位杂交实验证实, Ｃ Ｃ Ｋ 参与了癫痫发作过程。     

细胞核DNA图像分析及PSA检测在前列腺癌诊断中的应用

目的:探讨DNA图像分析技术及血清前列腺特异性抗原(PSA)水平检测在前列腺癌(PC)诊断中的应用价值。方法:应用计算机图像分析技术测定5例正常前列腺(NP)和30例PC的标本DNA倍体;应用ELISA方法检测30例PC患者血清中PSA。结果:5例NP中均为整倍体(2C和3-4C),30例PC中有23例出现非整倍体,并且随着PC分级的增高,其倍体率也增大;25例前列腺癌患者血清PSA值高于正常值。7例整倍体患者6例血清PSA不正常,5例PSA正常者中4例为非整倍体。结论:细胞核DNA含量和倍体及血清PSA的测定是反映前列腺癌细胞增殖分化能力的重要生物学指标,为正确诊断恶性肿瘤提供依据。     

妇科恶性肿瘤患者DNA倍体分析及其临床意义

目的探讨DNA倍体分析对妇科恶性肿瘤的应用价值。方法应用流式细胞术(FCM)测定78例妇科恶性肿瘤患者癌细胞DNA含量,并对DNA倍体和细胞周期各时相比例进行分析。结果妇科恶性肿瘤患者异倍体率和S期增高率分别为50.0%、42.3%,并且50岁以上患者明显高于50岁以下者,有明显差异(P<0.01);腺癌明显高于鳞癌(P<0.05);卵巢癌异倍体率及S期异常率最高,而宫颈癌最低;随病理分级的增高,异倍体率及S期异常率也呈增高的趋势。结论妇科恶性肿瘤患者DNA倍体的分析,可以有效地了解肿瘤细胞的增殖情况及恶变程度,从而指导治疗、改善预后。     

硫辛酸对细胞DNA损伤保护作用的初步研究

目的:用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)研究不同浓度过氧化氢(H2O2)分别作用于HepG2细胞2 h后DNA损伤的剂量效应关系,同时观察硫辛酸对H2O2损伤细胞DNA的保护作用. 方法: 将细胞分为对照组、损伤组和保护组,依次加入不同浓度的H2O2及硫辛酸,应用SCGE检测H2O2引起细胞DNA损伤. 结果: 随着H2O2浓度的增加,细胞DNA的损伤程度加重,能使尾长、尾部DNA百分含量和尾距显著增加(P《0.05). 硫辛酸能使H2O2损伤细胞的尾长、尾部DNA百分含量和尾距均较对照组减少(P《0.05). 结论: H2O2对细胞DNA损伤具有剂量效应关系,硫辛酸可以有效地减少H2O2引起的细胞DNA的断裂损伤.     

从梳子上提取DNA检验1例

1 材料和方法 一老年妇女于2007-08携带一把梳子(为其儿子生前一人所用),要求对梳子上所留DNA和其孙女的DNA进行父女亲权鉴定.采集梳子上脱落细胞DNA的方法:将小块纱布用双蒸水浸湿,擦拭梳齿数根,将擦拭物置于1.mL Eppendorf管中,室温下用去离子水浸泡4 h,振荡洗涤,12 000 g离心10 min,收集沉渣,如此反复3次以充分获取梳子上的人体脱落细胞.