早发性和迟发性帕金森病患者parkin基因的检测

目的观察早发性帕金森病(EOP)和迟发性帕金森病(LOP)患者中parkin基因的突变情况.方法EOP17例,LOP27例.抽取患者外周血后提取DNA,PCR扩增parkin基因Exon3、4、5、7,琼脂糖凝胶电泳鉴定外显子缺失突变,单链构象多态性检测点突变.结果17例EOP中存在Exon3和Exon5联合缺失1例,27例LOP中存在Exon5缺失1例.单链构象多态性未发现单链泳动异常.4例有家族史的患者中存在parkin基因突变1例(25%),40例散发患者中存在parkin突变1例(2.5%).结论无论是EOP还是LOP患者中均可检测到parkin基因突变.     

稳定表达野生型PINK1蛋白SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征(AREP)PINK1基因真核表达载体,建立稳定表达PINK1蛋白的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增PINK1基因全长cDNA编码区序列,重组DNA技术定向插入真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)B,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,挑选出稳定转染的单克隆株,经提取gDNA进行PCR扩增、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测PINK1基因在DNA、mRNA水平及蛋白水平的表达。结果成功构建了PINK1-pcDNA3.1-myc-his-(-)B真核表达载体,稳定转染SH-SY5Y细胞后,经提取gDNA扩增、RT-PCR及Westernblot检测到了野生型PINK1基因在基因组的整合、转录和蛋白水平表达。结论构建了PINK1基因真核表达载体和稳定表达PINK1蛋白的SH-SY5Y细胞株,为进一步研究PINK1基因功能及AREP发病机制提供了一个转基因细胞模型。     

1个帕金森病德国大家族PINK1基因纯合和杂合突变的临床谱:单突变的作用如何?

背景:尽管PTEN诱导激酶1(PINK1)基因的杂合突变已明确与早发帕金森病(PD)有关,但关于PINK1基因单杂合突变的作用尚知之甚少。目的:探讨PINK1基因纯合和杂合突变在1个德国大家系(W家族)中的作用。设计:PINK1基因突变分析和由3位独立的运动疾病专家实施的标准神经系统和运动检查结果,包括盲法录像评级。机构:Lübeck大学。受试者:20例家族成员。主要观察指标:所有家族成员的PINK1基因型和PD表现。结果:W家族的索引患者具有纯合无义突变(c.1366C>T,p.Q456X),并有酷似原发性PD的表现,但发病年龄在39岁。该家族包括4例受累的纯合…     

帕金森病基因PINK1和DJ-1的转录水平在神经毒损伤的MN9D细胞中的不同变化

目的在细胞水平上探究神经毒素作用下,关键的帕金森(Parkinson's disease)致病基因PINK1和DJ-1的转录情况,并从表观遗传学角度对其机制进行初步探索。方法本研究使用MN9D细胞系作为研究对象。通过台盼蓝活细胞计数的方法筛选神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基嘧啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)的半数致死剂量。通过半定量RT-PCR方法检测DJ-1基因和PINK1基因转录情况。通过RT-PCR以及免疫细胞荧光染色方法检测DNA去甲基化酶TET1的转录表达情况。结果 1)MN9D活细胞数在6-OHDA和MPP+作用下均发生了时间、剂量依赖性降低,6-OHDA和MPP+的半数致死剂量分别约为10μmol/L和100μmol/L。2)DJ-1的mRNA水平在6-OHDA或MPP+作用下未发生改变,而PINK1的mRNA水平则发生了明显的时间依赖下降。3)DNA去甲基化酶TET1的转录表达水平也发生显著下降。结论神经毒素作用下,帕金森病致病基因PINK1的转录发生下调,并可能是由DNA去甲基化酶TET1表达下调所介导的。     

50例帕金森病 PINK1基因5号外显子的多态性分析

目的探讨广西地区帕金森病(PD)的同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(PINK1)基因5号外显子的多态性分布特征,及其与PD的关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、DNA直接测序等技术对广西地区28例早发PD组患者、22例晚发PD组患者(早发PD组+晚发PD组为PD组)及55名健康对照组的PINK1基因5号外显子的多态性进行分析。结果 PINK1基因5号外显子G12164A、IVS5-5G-A(内含子上游调控区5-5G-A)连锁多态,统计结果显示PD组基因型G/A、A/A(42.0%)与对照组(23.6%)相比有升高趋势(χ2=4.034,P=0.045),晚发PD组基因型G/A、A/A(45.5%)与对照组中38名年龄大于50岁的健康人(21.1%)相比有升高趋势(χ2=3.951,P=0.047),各组之间的等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 G12164A、IVS5-5G-A连锁多态可能是广西地区晚发PD患者的易感因素。     

常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征6型PINK1基因的突变分析

目的探讨常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征6型(PARK6)。PINK1基因的突变及临床特征。方法应用聚合酶链反应(PCR)、DNA直接测序和限制性内切酶酶切等技术对11个常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征家系先证者进行PINKl基因的突变分析。结果在两个家系中检测出PINK1基因两个新的点突变：位于第4外显子938位的C→T,导致所编码的313位氨基酸由苏氨酸变为蛋氨酸(1313M);位于第7外显子1474位的C→T,导致第492位提前出现终止密码子,截短了后面90个氨基酸。在另一个家系中检测出一个同义突变(Y454Y)。具有PINK1基因突变的患者临床特征包括发病年龄早,病情进展慢,腱反射活跃,症状波动明显,睡眠后症状减轻,对小剂量多巴制剂反应良好,未见到由左旋多巴诱导的运动障碍。结论。PINK1基因突变是常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征的常见病因;我国大陆存在PARK6家系;PARK6具有临床异质性。     

欧洲和北非早期发病帕金森综合征中的PINK1基因突变分析

帕金森病是主要由黑质多巴胺能神经元缺失所导致的一种常见疾病。已在退行性早发性帕金森病的家族中发现,除parkin和DJ-1基因之外的PTEN诱导激酶(PINK1)基因突变。在177例发病年龄≤60岁的常染色体隐性遗传性帕金森病家族成员(主要来自欧洲)中筛查parkin和PINK1基因突变。在7个不相关的家族中,鉴定出10个致病性PINK1突变(5个错义突变、2个无义突变和3个移码缺失突变),其中的8个为新发现的突变,所有突变均呈纯合或复合杂合状态。有趣的是,在1个有2种不同突变的家族中观察到拟显性遗传。12例PINK1突变患者和114例parkin突变患者的临…     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

嗜中性粒细胞胞质因子1基因C923T多态性与长沙市汉族人群脑出血的相关性研究

目的:探讨嗜中性粒细胞胞质因子1(NCF1)基因第10外显子C923T(Ala308Val)多态性与湖南省长沙市汉族人群脑出血的关系.方法:采用PCR-单链构象多态技术和DNA直接测序法检测湖南省长沙市汉族人群脑出血患者110例、10个脑出血家系成员110例和健康对照者100名的NCF1基因第10外显子C923T多态性...     

新疆地区维、汉族T2DM患者FOSL2基因DNA甲基化水平分析

目的探讨新疆地区维吾尔族与汉族T2DM患者FOSL2基因DNA甲基化情况,揭示新疆维族与汉族T2DM发病的分子机制及进一步提供新的防治措施。方法收集2013年10月至2014年10月新疆喀什维、汉族T2DM患者各50例,测量并记录他们的一般临床指标。采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。结果 (1)与汉族T2DM组患者相比,维族T2DM组患者BMI、HbA1C、TC、TG、FPG、水平较高;(2)与汉族T2DM组患者相比,维族T2DM组FOSL2_3_68等多个位点平均甲基化率较高。结论新疆地区维族T2DM患者FOSL2基因DNA多个位点的甲基化率均高于同地区汉族人群,其DNA甲基化可能与其肥胖及糖脂代谢的异常相关。     

A different spectrum of DMD gene mutations in local Chinese patients with Duchenne/Becker muscular dystrophy

Background Duchenne muscular dystrophy （DMD） and Becker muscular dystrophy （BMD） are X-linked recessive, allelic disorders. This study was conducted to look into the spectrum of DMD gene mutations in Hong Kong Chinese patients with Duchenne or Becker muscular dystrophy （DMD/BMD）, and to study genotype-phenotype correlation.     

小插入与小缺失突变律:频数与碱基数的平方成反比

在基因突变中,小突变较大突变发生率要高.其中,小插入与小缺失突变的频率随突变碱基数的增加而递减.通过对HGMD的数据分析,这一突变频数的递减具有与小插入和小缺失突变碱基数的平方成反比的趋势.     

灵芝提取物对MPP+诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响

目的 观察灵芝提取物（Ganoderma lucidum extract,GLE）对1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP⁺）诱导的Neuro-2a细胞自噬的调节作用。方法 采用蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。同时Western blotting法检测AMPK/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin、NIX/LC3蛋白的表达水平。结果 激光共聚焦采集图像结果显示,MPP⁺处理组细胞LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上,观察到呈点状聚集状态,而GLE干预组细胞点状聚集状态不明显。以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比评价自噬水平的高低。MPP⁺组呈绿色点状分布的LC3阳性细胞百分比明显升高,GLE组明显降低。Western blotting法检测结果显示GLE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。同时,经GLE处理后,可以改善MPP⁺损伤引起的AMPKα/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin通路各蛋白异常表达。结论 GLE能抑制MPP⁺诱导的Neuro-2a细胞的自噬反应,调节细胞自噬相关蛋白AMPK/mTOR/ULK1以及PINK1/Parkin的异常表达,表明GLE可能通过调节细胞自噬而发挥神经保护作用。     

中国西南地区170例杜氏/贝氏肌营养不良症dystrophin基因变异谱分析

目的 构建中国西南地区杜氏/贝氏肌营养不良症（DMD/BMD）dystrophin基因变异谱,探讨dystrophin基因型与临床表型之间的关系。方法 采用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）对170例DMD/BMD患者进行dystrophin基因分析,其中3例怀疑点突变患者采用Sanger测序分析基因突变位点。结果 Dystrophin基因突变MLPA检出率为72.94%,其中基因缺失、重复及点突变所占比例分别为62.35% (106/170), 8.82% (15/170)及1.76% (3/170)。共发现64种不同类型突变,连续外显子44~55缺失突变型占全部缺失型患者的75.47%。大部分5′端断裂点集中在2个热区（主热区:内含子43~55;次热区:内含子1~20）。基因型-表型分析显示DMD/BMD严重程度与基因缺失型或重复型无关,而与改变开放阅读框架型突变有关（ r=0.640, P<0.001)。结论 连续外显子缺失或重复是dystrophin基因突变的主要类型,DMD/BMD严重程度与其改变开放阅读框架型突变有关。     

河北地区55例苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测与分析

目的 了解河北地区苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变情况,分析该地区PAH基因的突变谱及突变特点.方法 联合应用PAH基因全部外显子及外显子-内含子交界区扩增测序和多重连接依赖式探针扩增(MLPA)方法,对2007年9月至2009年7月就诊的55例来自河北地区的PKU患者进行PAH基因点突变和拷贝数改变的检测.对发现大片段缺失的个体,用跨越断裂位点(Gap) -PCR-测序方法确定断裂点精确位置.结果 110个PAH等位基因中检出突变等位基因108个,突变检出率为98.2％.共发现PAH基因突变41种,涉及11个外显子,包括错义突变24种、无义突变7种、剪接位点突变7种、小的缺失1种和大片段缺失2种,其中4种错义突变(p.Pro147ku,p.Gly289Arg,p.Phe392Ser,p.Ile421Thr)和2种大片段缺失突变(- 4163_ - 406del和- 1932_+ 3402del)为国际首次报道.55例患者中以下3种突变所占比例最高:p.Arg243Gln(12.7％)、c.611A ＞G(11.8％)和c.1197A ＞T(9.1％).结论 中国河北地区PKU患者中PAH基因的突变分布广泛;突变类型大部分为单碱基替换,但是大片段缺失也占一定比例.     

线粒体激酶PINK1的功能及其在神经退行性疾病与肿瘤中作用的研究进展

PINK1是一种线粒体丝苏氨酸蛋白激酶,其在氧化应激诱导的线粒体功能失调中起保护性作用.线粒体膜电位去极化时,PINK1募集parkin蛋白诱导线粒体自噬.生理状态下,PINK1在线粒体中被剪切并释放入胞质促进神经元分化.PINK1突变能够导致常染色体隐性早发帕金森病.在非神经退行性疾病中,PINK1通过激活胞质AKT信号通路、与线粒体抗凋亡蛋白Bcl-XL相互作用等机制,调节神经胶质瘤、乳腺癌等肿瘤细胞的生长与凋亡.本文对PINK1的生理功能及其在神经退行性疾病和肿瘤发生过程中的作用进行综述.     

帕金森病相关基因α-突触核蛋白和PINK1对Nurr1的调节作用

目的 探讨帕金森病相关基因α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)对转录因子Nurr1的调节作用。方法 利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的方法检测α-syn与Nurr1的相互作用。同时,在PINK1基因敲减的细胞模型中,通过双荧光素酶报告系统检测PINK1对Nurr1转录激活活性的调节作用。结果 FRET检测显示,CFP-α-syn与YFP-Nurr1之间发生了荧光共振能量转移的现象。其FRET效率大约为20.52%。提示α-syn与Nurr1之间可能存在直接的相互作用。对于PINK1基因敲减的细胞进行研究发现,在PINK1被抑制表达24 h或48 h后, Nurr1的活性显著下调。结论 以往研究提示α-syn可能是Nurr1的抑制因子。研究显示α-syn可能与Nurr1直接结合而抑制其活性。 而PINK1对Nurr1可能存在一个正性调节作用。因此,二者对Nurr1的调节可能存在一个相互协调、相互制约的关系。     

COL7A1基因在营养不良性大疱性表皮松解症的突变研究

目的 探讨COL7A1基因在营养不良性大疱性表皮松解症中突变的基因型与临床表型的关系。方法 收集14例营养不良性大疱性表皮松解症家系,皮肤活检进行常规组织病理、免疫荧光及电镜检查,采集外周血,提取基因组DNA进行COL7A1基因突变筛查。结果 显性遗传型中的3个家系为COL7A1基因错义突变所致,泛发性隐性遗传型中4个家系结合了两个提前终止密码子突变,另外3个结合一个提前终止密码子和剪切位点或甘氨酸错义突变,3个局限性隐性遗传型家系则由提前终止密码子和错义突变引起。结论 显性遗传型由甘氨酸错义突变所致,隐性遗传型则包括无义突变、剪切位点突变、插入或缺失突变等。     

迷迭香酸激活Parkin介导的线粒体自噬并抑制高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 评估迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞线粒体自噬水平以及细胞肥大的影响。方法 体外培养H9c2大鼠心肌母细胞,分为对照组（葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖25 mmol/L）、高糖+迷迭香酸组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L）、高糖+迷迭香酸+Parkin-siRNA组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L+Parkin-siRNA转染）;Western blot法测定PINK1、Parkin、LC3II/LC3I蛋白表达水平,透射电子显微镜下观察线粒体自噬体形成情况,流式细胞术检测活性氧物质（ROS）与凋亡水平,分光光度法检测细胞线粒体呼吸链复合酶活性,荧光酶标法检测线粒体膜电位水平,3H-亮氨酸标记法检测细胞蛋白质合成速率,光学显微镜下检测心肌细胞表面积。结果 迷迭香酸可提高高糖培养下心肌细胞内PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I蛋白表达水平（P<0.05）,增多线粒体自噬体数量,并抑制高糖诱导的ROS生成、恢复线粒体呼吸链复合酶活性与线粒体膜电位水平（P<0.05）,抑制高糖诱导的细胞凋亡（P<0.05）,并降低心肌细胞表面积与蛋白质合成速率（P<0.05）。利用Parkin-siRNA抑制心肌细胞线粒体自噬,则阻断了迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞氧化应激与心肌细胞肥大的保护作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可通过激活Parkin介导的线粒体自噬,对高糖诱导心肌细胞的氧化应激损伤有保护作用,并改善心肌细胞肥大。