截短型人凋亡诱导因子AIF1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的:观察人截短型AIF(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用。方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1～400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果:经酶切鉴定与测序证实,AIF△1-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达,电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论:人截短型AIF(AIF△1-400)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因，经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域（1-120位氨基酸）的编码序列，从而获得人截短型AIF（AIF△1-120）基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白（EGFP）共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察。免疫组织化学检测，间接免疫荧光检测，电镜观察等方法。检测目的基因在转染细胞中的表达，以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果：成功地构建了人截短型AIF（AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后，可检测到人截短型AIF分子的表达，随着转染后时间的延长，可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论：人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

ImmunoAIF△1-480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

目的:观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C-末端结构域编码区重组, 然后将R9-AIF△1-480基因与pCMV-e23sFv载体重组, 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480真核表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 经G418筛选, 建立稳定转染的细胞株, 通过RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性.结果:经过酶切鉴定与测序证实, 带有ImmunoAIF△1-480基因的真核表达载体构建成功, 经RT-PCR、Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达, 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞SGC-7901和SKBR-3有明显的促凋亡活性, 而对不表达HER2分子的ECV-304细胞几乎没有影响.结论:ImmunoAIF△1-480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞.     

重构型Caspase-6对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 将人Caspase-6基因大小亚基顺序颠倒，表达为重构型Caspase-6分子，探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 RT－PCR获取人Caspase-6基因，测序判断正确后，通过重组PCR的方法构建大小亚基顺序颠倒的重构型Caspase-6（RevCasp6)基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白（GFP）蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP中，转染人宫颈癌细胞系HeLa，在荧光显微镜下观察细胞形态的变化，用电子显微镜进一步观察细胞的凋亡特征。结果 获得了人Caspase-6基因，并成功地构建了大小亚基顺序颠倒的Rev-Casp6基因。以构建的RevCasp6真核表达载体，转染HeLa细胞后，荧光显微镜观察到细胞生长不良，细胞核结构破坏和细胞死亡。电子显微镜观察显示，转染了RevCasp6基因的细胞呈凋亡的典型特征。结论 RevCasp6基因具有诱导HeLa细胞凋亡的作用。     

TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达

目的:构建TRBP及其截短体真核表达载体, 并检测其在HeLa细胞中的表达.方法:设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、 TAC、 TBC基因序列, 然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlag-CMV4.用脂质体法转染HeLa细胞, 经 Western blot方法检测目的基因在转染细胞中的表达.结果:经过酶切鉴定与测序证实, TRBP全长及其截短体TAB、 TBC、 TAC基因真核表达载体构建成功, 经Western blot可检测转染细胞中各基因的表达.结论:成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体, 在转染细胞中可以检测到目的基因的表达.     

免疫凋亡素e23sFv-Fdt-RC6对HER2阳性胶质瘤细胞U251的杀伤作用

目的:探讨靶向活性caspase-6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251的促凋亡作用.方法:利用白喉毒素furin酶识别序列(Fdt)连接抗HER2单链抗体基因e23sFv和重构型caspase-6(RC6)基因,连接入pCMV载体,构建重组基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6.脂质体转染HER2阳性胶质瘤U251细胞系,Western blot检测目的蛋白的表达.流式细胞术(FCM)检测转染后U251细胞的凋亡率,MTT法检测目的基因转染后对U251细胞增殖的影响.结果:双酶切及基因测序证实,pCMV-e23sFv-Fdt-RC6载体被成功构建.Western blot检测到转染表达载体48 h后的U251细胞中有活性caspase-6的表达.FCM检测到实验组细胞凋亡率比对照组显著增高.MTT实验观察到转染载体pCMV-e23sFv-Fdt-Rc6的U251细胞的增殖被明显抑制.结论:e23sFv-Fdt-RC6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251有明显的促凋亡作用.     

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论 :tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡     

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人caspase-8催化结构域基因片段，并将其改建成2种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因，转染HeLa细胞，观察重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响。方法 用RT－PCR法，克隆人caspase-8催化结构域基因片段，经重组PCR改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pIRES2-EGFP，转染HeLa细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。结果 用RT－PCR法，成功地克隆了人caspase-8催化结构域基因片段，构建了3种重构型人caspase-8基因及其真核表达载体。转染HeLa细胞后，重构型人caspase-8基因的表达可导致HeLa细胞死亡。结论 重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地引起HeLa细胞死亡。     

GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性。方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的凋亡。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

GFP共表达检测重组型Caspase—3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 探讨由野生型人caspase-3大小基颠倒构建重组型capase-3的促细胞凋亡活性。方法 用TR－PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR 进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染入HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论 重组型caspase-3可促进HrLa细胞的凋亡。     

表达BG4蛋白对人胃癌AGS细胞凋亡和端粒酶逆转录酶表达的影响

目的:构建G-四链体抗体BG4基因的真核表达载体p EGFP-N1-BG4,探讨转染该真核表达载体致BG4蛋白过表达对人胃癌细胞株AGS凋亡和端粒酶逆转录酶表达的影响。方法:以BG4基因原核表达载体p SANG10-BG4为模板,PCR扩增出含有BG4基因的目的片段,经TA克隆与p MD18-T载体连接,测序正确后,经Sac I和Pst I双酶切,与真核表达载体p EGFP-N1连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,并进行酶切分析和序列测定,Western blot鉴定BG4蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期;DAPI法及HE染色检测各组细胞凋亡;q PCR和Western blot检测空白对照组、p EGFP-N1组和p EGFP-N1-BG4组端粒酶逆转录酶mRNA和蛋白表达的变化。结果:酶切分析显示,目的基因条带与预期结果相符,DNA测序表明克隆的BG4基因序列正确,Western blot结果表明转染p EGFP-N1-BG4质粒可以成功表达BG4蛋白。转染p EGFP-N1-BG4质粒可抑制细胞进入S期。DAPI法及HE染色显示,p EGFP-N1-BG4组出现明显的新月形核和核固缩的细胞凋亡现象。q PCR和Western blot结果表明,p EGFPN1-BG4组端粒酶逆转录酶表达受到抑制。结论:用p EGFP-N1-BG4真核表达载体转染胃癌细胞株AGS可以抑制该细胞端粒酶逆转录酶表达,诱导细胞凋亡。     

HAX-1对Jurkat细胞的抗凋亡作用研究

目的 研究HAX-1过表达在T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞中的抗凋亡作用.方法 构建HAX-1真核表达载体pEGFP-C3-HAX-1并转染Jurkat细胞.分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测HAX-1的表达,然后通过光镜、电镜以及TUNEL法检测在去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等不同处理因素下HAX-1过表达Jurkat细胞的凋亡情况.结果 构建的表达载体经酶切和测序鉴定序列正确,载体构建成功;PCR 及 Western blot 结果表明,转染后HAX-1的表达水平明显高于对照组(P＜0.01);经检测过表达HAX-1的Jurkat细胞具有明显的抗凋亡作用,能够对抗去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等的凋亡诱导作用.结论 HAX-1基因在Jurkat细胞中过表达具有明显的抗凋亡作用.     

NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用

目的：探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法：用RT-PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后，将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中，并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。用光镜观察转染细胞的形态变化；荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位；流式细胞仪分析细胞周期的改变；透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果：获得了NDRG2基因，成功地构建了pIRES2-EGFP-NDRG2真核表达载体。转染HepG2细胞后，细胞生长受抑，结构破坏并死亡。荧光显微镜观察到NDRG2在胞质中表达，流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰，透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论：NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，其机制有待进一步研究。     

ING4基因的克隆及其诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

 目的：分离小鼠ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 观察ING4基因转染人宫颈癌HeLa细胞后对细胞凋亡的影响。方法:应用RT-PCR技术从小鼠肝组织中扩增得到ING4cDNA。利用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4并用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,然后利用阳离子脂质体lipofectamine将其转染HeLa细胞，用RT-PCR检测ING4基因的表达情况，应用荧光显微镜（Hoechst33258染色）、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约 750 bp 的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.0-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现 750 bp 大小的条带，基因测序正确, Hoechst33258染色发现pcDNA3.0-ING4转染HeLa细胞的凋亡率（21.25%）明显高于对照组pcDNA3.0转染HeLa细胞的凋亡率（8.91%,P<0.01）。共聚焦显微镜也观察到了典型的细胞凋亡。细胞周期检测显示S期细胞所占百分数pcDNA3.0-ING4转染组高于pcDNA3.0转染组。结论:分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 初步研究发现该基因转染HeLa细胞后可促使细胞凋亡。     

PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC作用的研究

目的：研究PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC细胞恶性表型及凋亡的影响。方法：将PTEN真核表达载体pBabe-PuroPTEN及空质粒pBabe-Puro，通过脂质体介导的基因转染方法，转入该基因表达缺失的HHCC细胞系中，嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞。通过平板克隆形成试验、DNA凝胶电泳、相差显微镜和电镜，观察PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC恶性表型及凋亡的影响。结果：转染后的细胞，经原位杂交、免疫组织化学检测证实，有PTEN mRNA及其蛋白的表达；平板克隆形成试验证实，转染PTEN基因后，细胞形成克隆的能力降低；转染PTEN的细胞在相差显微镜和电镜下可出现典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖凝胶电泳呈现出明显的梯状条带。结论：外源性PTEN基因导入HHCC细胞后，可降低HHCC的细胞的恶性表型，并促进凋亡发生。     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体，转染肝癌细胞，Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低，流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达，同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其下调凋亡因子caspase-9效应的研究

构建自噬基因Beclin 1的小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,脂质体包裹后体外转染人宫颈癌HeLa细胞株,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响,并检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡情况以及凋亡因子caspase-9 mRNA及蛋白表达的变化。结果表明shRNA真核表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染后细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低,并伴有caspase-9 mRNA及蛋白量的显著下调。因此,Beclin 1不仅与自噬调控通路有关,而且可以调控凋亡的发生,同时参与两种程序性细胞死亡的过程。     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。