四川省结核分枝杆菌VNTR分型研究

目的评价不同串联重复序列(VNTR)位点在四川省结核分枝杆菌中的基因多态性,以及不同VNTR位点组合在四川省结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法采用多位点数目可变串联重复序列分析技术(ML-VA)对102株四川省结核分枝杆菌菌株的15个VNTR位点进行分析,基因多态性分析采用Hunter-Gaston指数,聚类分析采用BioNumerics软件。结果 15个VNTR位点的基因多态性存在较大的差异,位点Mtub21(HGI 0.772)和MIRU26(HGI 0.764)的多态性较高,ETR-C(HGI 0.168)和MIRU23(HGI 0.077)的多态性较差。ETR-B和ETR-C两个位点在对四川省北京基因型结核分枝杆菌进行分型时则不具有多态性。对不同的VNTR位点组合进行比较,随着VNTR位点的增加,VNTR分型方法的分辨能力也有所提高。10个VNTR位点组合的分辨指数与15位点组合的分辨指数相差不大。同一VNTR位点在不同地区北京基因型菌株中的分辨力也存在较大的差异。结论不同VNTR位点在四川省结核分枝杆菌中具有不同的分辨力,并且同一VNTR位点在不同地区的北京家族菌株中的分辨力也不同。10个VNTR位点组合的基因分型方案可用于四川省结核分枝杆菌基因分型的一线方法。本研究的数据结果对挑选适合中国结核分枝杆菌基因分型的VNTR位点组合法具有重要的作用。     

VNTR位点对结核分枝杆菌基因分型的研究

目的：初步评价15个可变串联重复序列（VNTR）位点对结核分枝杆菌临床分离株的分型能力,寻找适合湖州地区结核分枝杆菌基因分型的位点。方法2011年1-4月连续收集湖州地区结核分枝杆菌临床分离株,采用多位点数目多位点串联系复序列（MLVA）分析方法,对15个VNTR位点进行基因多态性检测,分析单个位点以及15个位点组合的基因分型能力（Hunter-gaston指数,HGDI）。结果分辨率较好的多态性位点有2个：Mtub-21和Mtub -39;分辨率中等的多态性位点共7个：ETR-A,ETR-C,MIRU -10,MIRU -23, MIRU-27,MIRU-40和Mtub-30;分辨率较差的多态性位点有6个：ETR-B,ETR-D,ETR-E,MIRU-16和MIRU-26和MIRU-39。通过计算,本次研究运用15个位点进行基因分型的 HGDI 为0.99,分辨能力好。结论 VNTR位点对结核分枝杆菌基因的分辨力较好,但还需继续寻找其他丰富多态性的VNTR位点,以便快速分型,提高分辨力。     

不同串联重复序列位点组合用于中国结核分枝杆菌基因分型的能力比较分析

目的 初步评价不同串联重复序列(VNTR)位点在中国8省市结核分枝杆菌基因分型中的应用,寻找适合中国地区结核分枝杆菌基因分型的位点组合.方法 从中国8个省(市、自治区)2800余株结核分枝杆菌临床分离菌株中以简单数字表法随机抽取140株,采用多位点数目可变串联重复序列分析方法(MLVA)对27个数目可变VNTR位点进行基因多态性检测,采用BioNumerics数据库软件进行单位点和不同位点组合的分辨率(Hunter-Gaston指数,HGI)分析,并比较分析其对140株菌的基因分型鉴定能力.同时采用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)将140株菌分为北京家族和非北京家族,评价上述不同VNTR位点组合在北京家族和非北京家族中的分型能力.结果 140株菌主要可分为2个基因群,即北京家族112株,占80%;非北京家族28株,占20%.Spoligotyping分型对140株结核分枝杆菌的HGI为0.4589.MLVA分析结果显示不同位点在不同菌株群存在明显的多态性,不同位点的HGI具有较大差异(0～0.809),对全部菌株、北京家族菌株、非北京家族菌株的HGI达到0.5以上的VNTR位点数分别为8、7和14个.27个VNTR位点进行不同的位点组合:优化筛选的8位点组合、国际推荐的12个、15个和24个位点组合.4个组合的HGl分别为0.9991、0.9882、0.9980和0.9986;在北京家族菌株中,上述组合的HGI依次为0.9987、0.9318、0.9969和0.9975;在非北京家族菌株中分别为1、0.9894、1和1.结论不同的VNTR位点和不同VNTR位点组合在中国8省市结核分枝杆菌中的HGI均存在明显差异;本研究优化的8个位点组合MLVA分型方法在中国结核分枝杆菌流行病学研究可能具有良好的应用前景.     

青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究

目的 初步了解青海省结核分枝杆菌临床分离株基因多态性和基因分型特征。方法 2009-2012年收集青海省疾病预防控制中心分离的结核分枝杆菌临床分离株,提取DNA,对15个可变数目串联重复序列(VNTR)位点进行PCR扩增和产物电泳分析,使用BioNumerics软件对菌株进行聚类分析。结果 共检测251株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点,显示这些菌株有明显的基因多态性,15个VNTR位点中Hunter-Gaston指数>0.6的VNTR位点有6个,位点分辨能力最高的是MIRU26,经聚类分析,可分为4个基因群,238个基因型。4个基因群分别占4.9%、91.9%、1.6%和1.6%。结论 青海省流行的结核分枝杆菌菌株存在明显的VNTR基因多态性。     

浙江省宁波地区结核分枝杆菌VNTR基因分型研究

目的初步探讨数目可变串联重复序列(VNTR)技术在宁波地区结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法根据文献选取7个分型效果较好的VNTR基因位点,应用聚合酶链反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳,分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果本研究组共对138株结核分枝杆菌的7个VNTR位点进行了检测,共产生7个基因簇和123个独立基因型,成簇率为5.80%,VNTR-7位点基因分型技术分辨率指数(HGI)为0.999 1。结论VNTR-7位点基因分型技术对宁波地区结核分枝杆菌的分析有较高的分辨力,操作简便,适用于宁波地区结核病分子流行病学研究。     

应用VNTR技术对绵阳地区结核分枝杆菌进行基因分型

目的应用数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTRs)分析技术探讨绵阳地区结核分枝杆菌的基因分型,为结核病的防治提供科学依据。方法选取绵阳地区结核分枝杆菌临床分离菌株,采用聚合酶链反应(PCR)分别对VNTR位点进行检测分析,应用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果共对79株结核分枝杆菌的15个VNTR位点进行了检测,结果显示明显的基因多态性。各个位点的分辨能力不同,QUB-11b位点的分辨指数(Hunter-Gaston index,HGI)最高,为0.880;ETR C的HGI最低,为0.234;总HGI达到1。经聚类分析,79株菌可分为7个基因群、79个基因型,以Ⅲ群和Ⅴ群所占比例较大,Ⅲ群含37株菌,占46.8%;Ⅴ群含33株菌,占41.8%,其他菌株呈散在分布。结论绵阳地区结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性,主要流行菌群为Ⅲ群和Ⅴ群,应加强此两群菌株的监控。     

结核分枝杆菌的检验与分型

目的 结核患者的结核分枝杆菌检验和分型.方法 采用PCR及琼脂糖凝胶电泳技术,针对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点做了检验,并应用Gel-Proanalyer3.0软件及BioNumerics(Version3.0)软件对检验结果做了相关的基因型分析,又分析了基因检测与分型之间的关系.结果 136株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型,成簇基因型占74.26％(101/136),单一基因型占25.74％(35/136).结论 耐药菌株的检测在分布上存在统计学的差别.     

结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究

目的了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含"利福平耐药决定区(RRDR)"在内的rpoB基因片段(385bp)进行扩增,并将扩增产物进行测序,以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列,分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果 40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变,结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变,突变率92.3%,且突变均位于RRDR区域内;突变位点为8个,共有8个突变类型;最常见的突变热点依次为531位点,该位点突变率为64.1%;526位点,其突变率为12.8%和516位点,其突变率为10.3%。结论 rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的最相关基因,其中在RRDR内的531位点基因突变率最高,并可通过对rpoB基因的突变检测,对耐多药结核病进行预测。     

44株HIV/MAV双重感染者MAV基因分型和药敏结果分析

目的 了解云南省西南地区人类免疫缺陷病毒(HIV)/鸟结核分枝杆菌(MAV)双重感染者MAV的基因型和耐药情况。方法 选取12个可变数目串联重复序列(VNTR)特异性位点,采用分枝杆菌串联重复序列(MATR-VNTR)基因分型法对MAV进行基因分型;采用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株DNA后进行琼脂糖凝胶电泳,获得MAV的DNA指纹图谱,再应用Quantity One和BioNumerics 6.7软件对电泳图进行数字化处理并通过非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。采用比例法测试44株MAV对10种不同抗菌药物的敏感性。结果 各位点VNTR基因分型的Hunter-Gaston指数(HGDI)存在差异,其中MATR-5最高,为0.68,MATR-1、2、3、4、6、7、9、13、15位点的HGDI值均≥0.5;通过聚类分析,44株MAV分为6个集群。药敏试验结果显示,利福布丁对MAV的体外抗菌活性最好(耐药率为0),其次是乙胺丁醇(耐药率86.4%,38/44),所有菌株对其余8种药物均耐药。结论 选取的12个位点VNTR基因分型法在云南省西南地区具有较高分辨率,来自云南省不同地区...     

15位点重复单元-可变数目串联重复序列技术在河南地区结核分枝杆菌的基因分辨率的对比分析研究

目的 比较15位点分枝杆菌散在重复单元-可变数目串联重复序列(MIRU-VNTR)对河南省结核分枝杆菌的分辨力与其他地区的区别。方法 使用Spoligotyping和MIRU-VNTR对菌株进行分型,分析北京家族基因型在性别、年龄和地区间的分布情况。将15个位点对本省菌株的分辨率与其他地区结果相比较。结果 本省东部地区患者感染北京家族结核的比例高于其他地区,尤其高于西部地区。本省55岁以上的人群更易感染北京型菌株。7个位点(Mtub04、MIRU10、MIRU39、MIRU31、Mtub21、MIRU26和Qub26)对河南菌株的分辨能力优于其他地区。15位点MIRU-VNTR结合Spoligotyping的分辨力高于我国其他大部分地区,但略低于上海和黑龙江。结论 北京基因型在本省的分布存在地区和年龄的差异。15个位点MIRU-VNTR的分辨力在本省和其他地区间存在明显不同,因此需针对本省菌株指定合适的分型方案。     

结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分型方法标准化操作程序的建立

目的 建立结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的标准化方法,评价该方法的分型能力、应用价值.方法 选取15个位点,采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对中国54株结核分枝杆菌临床分离株进行分型.结果确定标准化的MLVA方法,包括细菌分离培养、核酸提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳等实验步骤及标化参数的相关数据分析软件的使用.VNTR位点确定为ETRA、ETRB、ETRC、ETRD、ETRE、MIRU10、MIRU16、MIRU23、MIRU26、MIRU27、MIRU39、MIRU40、Mtub21、Mtub30和Mtub39.结论建立MLVA标准化技术方案,该方法操作简便,分型鉴定能力及实验室间结果可比性强,便于网络化,有利于结核病流行中追溯传染源,分析流行趋势.     

13个VNTR位点用于113株结核分支杆菌的基因分型研究

目的 应用数目可变串联重复序列（VNTR）分子分型技术，对北京地区113株肺结核临床分离菌株进行分型研究，探讨北京地区菌株DNA多态性和基因型特征。方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分支杆菌13个VNTR位点进行检测，并应用Gel-Pro analyzer 3．1软件和BioNumerics3．0软件进行结果分析。结果 113株结核分支杆菌可分为4个基因型（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型占92．0％（104/113），其他3型所占比例很小，分别为Ⅱ型占4．4％（5／113），Ⅳ和Ⅴ型均为1．8％（2／113），而标准菌株H37Rv在分型中为独立的一个基因型，即Ⅲ型。结论 北京地区的结核分支杆菌存在基因多态性，其主要流行型为Ⅰ型。     

不同可变数目串联重复序列组合对中国流行结核分枝杆菌分辨力的评价研究

目的 在规范化的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats,VNTR）基因分型的基础上,构建我国31个省（自治区、直辖市）VNTR数据库,每个省优化一套VNTR位点组合,为我国结核病预防控制策略的制定提供科学依据。方法 对2007－2008年全国结核病耐药性基线调查的4 116株MTB15位点VNTR（15-VNTR）基因分型。汉高指数（Hunter-Gaston Index,HGI）分析每个位点的分辨率。依据谱系流行特征,以分辨率高和稳定性强为原则,为各省设计一套VNTR优化组合（12-VNTR、10-VNTR、8-VNTR和5-VNTR）,采用HGI和成簇率进行评价。结果 完成了涵盖率为96.36%（3 966/4 116）MTB完整15-VNTR图谱。发现QUB11b、MIRU26等7个高分辨率位点;QUB26、MIRU16、Mtub21、QUB11b在部分地区遗传稳定性差。内蒙古自治区、重庆市、黑龙江省的最优组合为10-VNTR,其他各省的最佳组合为8-VNTR。结论 VNTR数据库的建立将推动全国范围MTB传染源的追踪;各省优化VNTR组合的推出有助于当地结核病疫情的监测和群体遗传学的研究。     

A first insight into the application of high discriminatory MIRU-VNTR typing using QIAxcel technology for genotyping Mycobacterium bovis isolated from the Delta area in Egypt

Mycobacterium bovis is a notorious infectious agent leading to serious economic losses for cattle farms worldwide. Analysis of the widely spreading genotypes is vital for tracing infections, understanding transmission dynamics, and controlling the cluster growth. This study aimed to evaluate the discrimination ability of 15 mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeats (MIRU-VNTR) loci and to assess the extremely efficient loci subset for molecular epidemiological investigations of M.bovis from farms in the Delta area of Egypt. The discriminating ability of MIRU-VNTR genotyping using 15 loci {2 exact tandem repeat (ETR) loci, 6 MIRU loci, 4 Mtub loci, and 3 Queen's University of Belfast (QUB) group loci)} were evaluated on 61 M.bovis isolates from cattle (Holstein Frisian) and buffaloes. The results indicate that there are 48 genotypes: 3 unique genotypes and 45 genotypes with shared similarities. Using the MIRU-VNTRplus database, M.bovis ID 7540/01 and ID 5346/02 were the nearest lineages to both groups. Six loci (MIRU10, QUB11b, QUB26, ETRA, Mtub30, and Mtub39) were highly discriminating, seven other loci (Mtub21, MIRU26, QUB4156, MIRU04 (ETRD), MIRU16, MIRU 40, and ETRC) gave moderate discriminatory power, and the last two loci (Mtub04 and MIRU31) were poorly discriminative. MIRU-VNTR typing generally proved efficacy and high discriminatory power, with a collective allele's diversification of 0.9641. Both the six highly discriminating (DI = 0.9492) and the seven moderately discriminating loci (DI = 0.9269) evidenced to be suitable for M.bovis first-step initial genotyping from cattle herds in Egypt. MIRU-VNTR is rapid and effective in the genotyping of M.bovis from cattle and buffaloes in Egypt.     

杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株的MIRU-VNTR基因分型研究

目的：探讨MIRU-VNTR技术在杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株基因分型中的应用。方法收集杭州市2010年4月-2012年6月各结核病定点医院分离培养的临床菌株,进行药物敏感性检测。分别采用RD105缺失基因检测法和MIRU-VNTR技术对氧氟沙星耐药株进行菌株鉴定和基因分型。结果筛选出的52株氧氟沙星耐药株中,43株（82.69%）为北京家族菌株。经12个MIRU-VNTR位点组合分析,52株氧氟沙星耐药株呈52种MIRU-VNTR基因型,总Hunter-Gaston指数（ HGI）为0.999。除MIRU40和ETR-F外,其他10个MIRU-VNTR位点对北京家族菌株和非北京家族菌株均显示较高或中等程度的分辨率。结论筛选到的10个MIRU-VNTR位点具有较高分辨率,适用于杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株分型。     

武汉市耐多药结核分枝杆菌的MIRU-VNTR分子特征

目的 描述武汉市耐多药结核分枝杆菌基因型分布及成簇特征。方法 选取15个结核分枝杆菌重复序列（mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU）,对98株耐多药结核分枝杆菌进行多位点数目可变串联重复序列分析（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing,MIRU-VNTR）分型,计算差异遗传值、Hunter-Gaston指数（Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI）、成簇率以及近期感染率最小估计值。结果 MIRU位点组合的多态性差异遗传值为0.960 4、HGDI为0.970 8,多态性和分辨指数最高的位点为Mtub 21及MIRU 26。共产生7个基因簇和65个独立基因型,成簇率为33.67%,近期感染率最小估计为26.53%。结论 15位点MIRU-VNTR分型法分辨指数较高,适合于武汉地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型。尽管武汉市耐多药肺结核病的流行多半归因于内源性复燃,但仍有较高比例的近期传播。     

Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics.

The recent introduction of molecular methods has gained increased acceptance as a powerful tool for epidemiology and phylogeny of tuberculosis (TB). In this investigation, the efficiency of molecular typing using mycobacterial interspersed repetitive units (MIRUs) was assessed on a set of 116 Mycobacterium tuberculosis complex clinical isolates from 11 different geographic origins. The results obtained were compared with spoligotyping and variable number of tandem DNA repeats (VNTRs) typing data. Eighty-nine different MIRU profiles were obtained on the sample studied. Spoligotyping- or VNTR-defined clusters were split into subclusters by MIRU typing. Conversely, almost all of the clinical isolates clustered by MIRUs were shown to belong to spoligotyping-based defined clusters. The calculation of the discriminative power by the Hunter-Gaston index (HGI) for VNTR, spoligotyping and MIRU typing gave the values of, respectively, 0.959, 0.965 and 0.988, showing the high discriminative power of the MIRUs. The allelic diversity of the sample was calculated for each of the MIRU-VNTR loci; five MIRU loci (MIRU nos. 10, 23, 26, 31 and 40) were "highly discriminant", four (MIRU nos. 4, 16, 24 and 39) were "moderately discriminant", and three (MIRU nos. 2, 20 and 27) were "poorly discriminant". Among the three complementary VNTRs (exact tandem repeats ETR-A, ETR-B and ETR-C), ETR-A was the most discriminant locus. A combined numerical analysis of spoligotyping, VNTR and MIRU typing results partly corroborated a recently hypothesized evolutionary scenario for the M. tuberculosis complex. M. canettii would be the first branch to have diverged from a common M. tuberculosis complex ancestor. The East-African Indian (EAI) clade could be the first family to have diverged thereafter. A third branching separated a M. africanum-M. bovis clade, followed by a node separating Beijing versus non-Beijing M. tuberculosis. The Beijing clade was distinct from the Central Asian 1 (CAS1) family. Among non-Beijing strains, branches such as the Latin-American and Mediterranean (LAM), X and Haarlem clades diverged later. In conclusion, the results obtained show the congruence between clades defined by spoligotyping, and MIRU-VNTR, and underline the potential of these methods for M. tuberculosis phylogeny reconstruction. We also conclude that MIRU typing is a very promising method that may be used in a "two PCR-based" genotyping strategy, in conjunction to conventional epidemiological investigations.