GM-CSF和多种细胞因子基因转导系统及其抗肿瘤免疫效应的研究

为了增强免疫基因治疗瘤菌诱导机体抗肿瘤系统免疫效应,我们应用逆病毒中介基因转移技术,将IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IFN-α、B7-1、TNF-α、GM-CSF等多种细胞因子基因导入肿瘤细胞,证实了这些基因修饰的肿瘤细胞.由于多种细胞因子基因的导入,诱导宿主抗肿瘤系统免疫能力明显增强.在此基础上,我们为了开发增强宿主免疫的肿瘤基因治疗新方案,构建了可以表达双价细胞因子GM-CSF、TNF-α、IL-4的逆病毒载体的基因修饰瘤苗.通过接种放射线灭活的分泌GM-CSF和IL-4细胞因子的肿瘤细胞即细胞因子肿瘤疫苗,来诱导有效地抗肿瘤系统免疫功能.应用构建的双价逆病毒载体和逆病毒中介基因转移技术,对肺癌、脑肿瘤小鼠模型进行了双价细胞因子基因瘤苗的抗肿瘤免疫增强效果和     

人TNF-α基因修饰成纤维细胞的抗肿瘤研究

近年来,白细胞介素4(IL-4)基因治疗的研究取得了很大进展并已试用于临床治疗晚期肿瘤.我们的实验也曾表明,IL-4基因转染的肿瘤细胞所制备的瘤苗对于实验性肺转移荷瘤小鼠具有一定疗效,该作用可能与IL-4基因的转染与表达对肿瘤细胞免疫原性的增强及IL-4对机体抗肿瘤免疫功能尤其是T细胞功能的激发有关;关于肿瘤     

携带TIP30与人IFN-γ 基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及抗腺样囊性癌的初步研究

目的:研究锚定表达GM-CSF的小鼠黑色素瘤作为肿瘤疫苗的有效性.方法:GM-CSF基因嵌合GPI信号肽修饰序列实现在B16小鼠黑色素瘤细胞表面的锚定表达,研究锚定修饰的B16细胞于同源C57BL/6小鼠的成瘤性及诱导抗肿瘤免疫的效果.结果:抑瘤实验结果表明,锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞免疫原性增强,成瘤性明显下降;成瘤率为58.8%,而肿瘤对照组为100%.活瘤苗接种实验结果显示锚定修饰的肿瘤细胞可以预防肿瘤的发生,肿瘤发生率仅为20%,说明抗肿瘤的免疫应答有记忆性,能够有效地防止野生型肿瘤细胞的攻击.结论:锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞可以诱导抗特异性的抗肿瘤反应,这种设计可以应用于肿瘤疫苗的研究中.     

GM—CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

目的研究GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的可行性.方法通过逆转录病毒载体,将小鼠GM-CSF基因导入EL-4淋巴瘤细胞中,研究EL-4/GM-CSF在同系C57BL/6小鼠中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果.结果EL-4/GM-CSF细胞在小鼠中的成瘤性下降,50%小鼠无瘤生存.射线灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗能有效地保护野生型肿瘤细胞的攻击,在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤小鼠进行治疗,能延长荷瘤宿主的存活时间(33.1±1.8)与对照组EL-4/Wt(23.2±1.5天)比差异有显著性(P＜0.01).基因修饰的瘤苗作用明显增强.结论GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗可诱导较强的抗肿瘤免疫反应,导致肿瘤的部分根除,本实验为基因修饰的肿瘤疫苗的临床应用提出了一定的实验依据.     

腺病毒介导IL-2基因转染的瘤苗体内抗肿瘤作用

目的 :探讨重组腺病毒介导的 IL- 2基因转染的瘤苗的体内抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法 :应用腺病毒介导的鼠 IL- 2基因转染 CT2 6小鼠结肠癌细胞 ,灭活后用作瘤苗治疗荷瘤小鼠 ,观察皮下肿瘤生长及其存活期。采用乳酸脱氢酶释放法检测荷瘤小鼠脾细胞 CTL、L AK、NK细胞的杀伤活性。结果 :鼠 IL- 2基因转染瘤苗治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤生长并明显延长其存活期 (P<0 .0 1)。体内免疫功能检测表明 ,鼠 IL- 2基因转染疫苗治疗组小鼠脾细胞 CTL 活性、L AK活性和 NK活性显著高于对照组 (P<0 .0 1)。结论 :腺病毒介导鼠 IL- 2基因转染的瘤苗体内具有较强的抗肿瘤效应 ,其机制可能是提高了荷瘤小鼠特异性和非特异性抗肿瘤免疫反应     

IL-2重组痘苗病毒修饰的肿瘤细胞破碎物局部应用后的抗肿瘤作用研究

细胞因子基因转染的瘤苗在体内具有明显的抗肿瘤作用,但逆转录病毒载体转染的肿瘤细胞作为瘤苗在制备及保存上仍然存在不足。本文采用编码人IL-2基因的重组痘苗病毒载体(rVV-IL-2)转染B16-F10小鼠黑色素瘤细胞,经超声破碎及高速离心,制成IL-2基因转染的肿瘤细胞破碎物(IL-2VBO),以此作为瘤苗,局部注射治疗荷瘤小鼠,结果明显抑制了小鼠肿瘤的生长,延长其存活期,外周血淋巴细胞对B16-F10细胞的杀伤活性明显增高,而对YAC-1细胞的杀伤活性则增加不明显,表明IL--2VBO诱导了机体对B16-F10特异性的免疫功能。由于IL-2VBO制备方便,易于保存,同时由于痘苗病毒本身可加强诱导出的免疫反应,因此可望作为一种新的瘤苗应用于肿瘤的主动性免疫治疗。     

联合自杀基因与IL-2基因转移疗法的抗肿瘤效果及其抗肿瘤免疫应答的诱导作用

单用自杀基因疗法或单用细胞因子基因疗法抗肿瘤效果不理想,本研究中我们观察了大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因与白细胞介素2(IL-2)基因联合转移对荷瘤小鼠的治疗效果及其对抗肿瘤免疫的诱导作用。复制荷瘤小鼠模型后在荷瘤部位注射表达CD基因的重组腺病毒(AdCD)及表达小鼠IL-2基因的重组腺病毒(AdIL2),并连续10天、每天1次腹腔注射5氟胞嘧啶(5FC)对荷瘤小鼠进行治疗。结果表明,AdCD/5FC/AdIL2联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长,并明显延长其生存期(P<0.01)。联合基因治疗组小鼠肿瘤细胞发生明显的坏死,瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润,瘤内CD4~ 和CD8~ T细胞明显增加,脾细胞NK和CIL杀伤活性明显高于单用AdCD/5FC、对照病毒AdLacZ/5FC或PBS组。实验结果表明,联合应用自杀基因与细胞因子基因治疗可更有效诱导机体的抗肿瘤免疫反应,从而更显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。     

白血病小鼠经IL-6基因转染瘤苗治疗后脾细胞诱生的细胞因子水平

本文在研究了人白细胞介素6(IL-6)基因转染瘤苗对白血病小鼠体内治疗作用及其部分免疫机理的基础上,进一步观察了IL-6基因转染瘤苗治疗白血病小鼠后产生细胞因子(包括IL-1,IL-2,IFN-γ,TNF及GM-CSF)水平的变化。结果表明,IL-6基因转染瘤苗在体内对小鼠脾淋巴细胞或腹腔巨噬细胞(Mφ)经诱导后分泌的上述细胞因子(除IFN-γ外)各组均有不同程度的促进作用。以此种新型瘤苗辅以低剂量IL-2和低剂量环磷酰胺(Cy)治疗后促进作用最为明显。从而为IL-6基因转染瘤苗治疗白血病的免疫学机理提出了新的认识。     

转基因人腺癌细胞株的建立及其生物学特性的研究

自Rosenberg等把Neo~R、TNF基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对晚期黑色素瘤患者进行治疗以来,肿瘤基因治疗开始问世并多集中于对细胞因子基因(IL-2,TNF,IFN-α,GM-CSF等)转导后抗肿瘤的研究.常用的方法是选择适当载体把细胞因子基因导入抗肿瘤的免疫效应细胞(TIL,LAK,CTL)或肿瘤细胞中,回输或接种机体,直接或间接杀伤肿瘤细胞,增强机体的免疫调节作用,从而达到治疗肿瘤的目的.     

瘤体内/瘤周注射TNF重组腺病毒和/或IL-2重组腺病毒对肝癌小鼠的治疗作用研究

选择两种具有协同免疫调节作用的细胞因子进行联合基因治疗是提高肿瘤细胞因子基因治疗的有效途径之一.目前对IL-2/TNF-α联合基因方案,特别是瘤体内注射途径的抗肿瘤研究尚未见报道.IL-2与TNF-α具有协同作用.因此我们分别将携带TNF-α基因和IL-2基因的腺病毒(Ad-TNF,Ad-IL-2)联合或直接注射于BALB/c小鼠肝癌内,观察其抗瘤效果,并探讨其抗肿瘤免疫机制.结果表明:1.TNF治疗组脾细胞NK、LAK、CTL活性及Mφ杀伤活性明显高于对照组,诱生的细胞因子包括IL-2、GM-CSF、IFN-γ、TNF和IL-     

雷公藤内酯醇对人宫颈癌细胞的凋亡诱导效应

目的:探讨腺病毒介导AFP基因修饰的DC(AFP-DC)瘤苗经不同途径免疫后机体抗肿瘤免疫应答反应.方法:采用皮下注射、静脉注射和瘤体注射三种途径回输AFP-DC瘤苗,比较观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用,应用4h51cr释放杀伤实验、T细胞与NK体内剔除实验等方法,观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用及保护性免疫反应.结果:皮下注射AFP-DC瘤苗治疗效果在抑制肿瘤生长、延长小鼠存活期方面都明显优于瘤体内注射或尾静脉注射(P＜0.05),AFP-DC瘤苗体内能更有效地诱导特异CTL细胞毒活性,能使免疫动物产生一定的免疫保护作用,抵抗肿瘤细胞的再攻击.在AFP-DC瘤苗诱导抗肿瘤免疫排斥反应过程中,必需有CD4 T和CD8 T细胞的参与;而在其效应阶段,则依赖于CD8 T细胞的参与,CD4 T细胞为非必需;在免疫诱导及效应阶段剔除NK细胞对抗肿瘤免疫应答无明显影响.结论:皮下注射AFP-DC瘤苗能有效诱导机体产生抗肿瘤免疫反应,为DC介导的肝癌免疫治疗开辟了新的途径.     

自体肿瘤瘤苗对荷瘤鼠Th1、Th2型细胞因子及细胞毒作用的影响

目的研究经处理的H22肝癌细胞肿瘤瘤苗作为全细胞瘤苗对H22荷瘤小鼠体内Th1/Th2细胞比例和细胞因子的影响以及CTL的杀伤活性.方法用加重组白细胞介素2、重组粒细胞单核细胞集落刺激因子及福氏不完全佐剂制成疫苗,建立荷瘤小鼠模型,用51Cr释放法测定瘤苗免疫组、荷瘤组、正常组小鼠脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测单个核细胞中的Th1和Th2细胞,并取血检测血清中IL-10、IFN-γ水平.结果效靶比为200:1时,免疫小鼠脾细胞体外杀伤亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于荷瘤组的13.6%,正常组的7.5%,以及对S180细胞的9.1%(P均＜0.05).瘤苗免疫组Th1细胞及Th1/Th2细胞的比值显著升高(P＜0.01),血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01);血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).结论肿瘤细胞加小剂量IL-2和GM-CSF及佐剂组成的肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应.     

IL-2、IL-4基因转染后B16细胞表面ICAM-1的表达及其肿瘤细胞致瘤原性的变化

IL-2、IL-4基因转染的肿瘤细胞接种至体内后致瘤原性显著下降甚至消失，但是由于所染的细胞因子基因、肿瘤细胞、细胞因子表达水平及动物模型等方面的差异这些细胞因子基因修饰的肿瘤致瘤原性下降的免疫学机理也有不同，但均与这些肿瘤细胞体内接种后，机体肿瘤免疫功能的增强有关，     

白介素-18基因修饰SW480细胞肿瘤原性改变及抗瘤作用研究

白介素-18(Interleukin-18,IL-18)能诱导T细胞和NK细胞产生IFN-λ,是参与启动细胞免疫反应的重要细胞因子,具有显著的抗肿瘤效应[1]。将细胞因子基因如IL-2等转移到肿瘤细胞制成的肿瘤瘤苗,能够诱导机体内抗肿瘤免疫功能[2]。我们将人白细胞介素-18(hlL-18)基因转导入大肠癌细胞系SW480细胞中,观察IL-18基因转染后,SW480细胞分泌IL-18的水平及SW480细胞致瘤性的改变。     

转4-1BBL 基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究

 目的 研究转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子（IL-2、TNF-α和GM-CSF）的能力。方法 以丝裂霉素C（MMC）处理高表达转m4-1 BBL基因的小鼠Hepa1-6肝癌细胞，制成肿瘤细胞瘤苗（TCV），体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后，观察其对脾细胞产生细胞因子（IL-2、TNF-α和GM—CSF）的影响。结果 TCV-4-1 BBL刺激后，脾细胞体外分泌细胞因子IL-2、TNF-α和GM-CSF的水平明显增高。结论 转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗能刺激脾细胞产生细胞因子IL-2、TNF-α和GM-CSF。     

GM-CSF基因修饰的不同肿瘤瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫功能的比较

GM-CSF作为一种重要的造血生长因子，能刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖分化，此外它还具有重要的免疫调节作用，尤其是其增强机体抗肿瘤免疫功能的作用近年来倍受重视。曾有报道，GM-CSF基因修饰的肿瘤瘤苗能诱导机体产生有效的保护性抗肿瘤免疫应答，在同一肿瘤模型中其作用强于用IL-2、     

腺病毒介导反义VEGF降低肿瘤诱导免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果

目的：本研究旨在探讨腺病毒介导的反义VEGF降低肿瘤诱导的免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果。方法：用反义VEGF修饰及反义VEGF与IL-2基因共同修饰MM45T，Li小鼠肝癌细胞，然后观察修饰后的肿瘤细胞的致瘤性；并在体内观察反义VEGF与IL-2基因诱导肝癌模型小鼠肿瘤细胞的凋亡，以及肿瘤组织中CD4^ ,CD8^ 细胞浸润情况。结果：反义VEGF降低了肝癌细胞MM45T.Li的致瘤性；增加了肿瘤组织周围CD4^ ,CD8^ 细胞浸润，改善了模型小鼠的免疫抑制状态，提高了IL-2抗肿瘤效果。结论：反义VEGF不仅可抑制新生血管的生成，而且可降低肿瘤诱导的免疫抑制，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别，与IL-2免疫基因治疗相结合可明显提高对肿瘤的杀伤效果。     

自杀基因与GM-CSF基因联合治疗对小鼠黑色素瘤的治疗作用及其机理研究

将小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因转移至肿瘤细胞内可以大大增加肿瘤细胞的免疫原性,有效诱导肿瘤细胞特异性的抗肿瘤免疫,但是该作用不够强大,对已建立的肿瘤作用较弱.而自杀基因治疗虽然可以消除肿瘤负荷,但是不能有效地诱导抗肿瘤免疫应答.本研究以腺病毒作用载体,将小鼠GM-CSF基因与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(CD)联合转移,在体内可以观察到显著的抗肿瘤作用.小鼠体内接种黑色素瘤B16F10细胞后3天,肿瘤局部注射表达GM-CSF的腺病毒载体Ad-GM-CSF和表达CD基因     

TNFα基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

如同联合应用两种具有协同作用的细胞因子可以达到更佳的免疫治疗效果一样，如果将两种具有协同作用的细胞因子基因共转染人一种肿瘤细胞内，此肿瘤细胞可能会具有更佳的抗肿瘤效果。IL-2和TNFα具有协同抗肿瘤作用和免疫调节作用。因此，本文选用IL-2基因和TNFα基因为共转染的目的基因，通过两步基因转移共转染人B16黑色素瘤细胞，观察了体内致瘤性和瘤苗效果。     

腺病毒介导的IL—2基因及B7—1基因联合转染G422细胞致瘤原性和免疫原性的变化

目的研究联合细胞因子基因转染的D422胶质母细胞瘤细胞体内致瘤原性和免疫原性的变化,为胶质瘤的免疫基因治疗打下基础.方法IL-2基因和B7-1基因转染的G422细胞1×105皮下和脑内接种,观察肿瘤生长速度和荷瘤小鼠的存活期,2周取脾脏,检测NK、LAK和CTL的杀伤活性.结果IL-2和B7-1基因联合转染的G422细胞,皮下接种后肿瘤生长明显减慢,脑内接种动物存活期明显延长,NK、LAK和CTL的杀伤活性增强.结论IL-2基因和B7-1基因联合转染的G422细胞,致瘤原性下降,免疫原性增强,能有效激活机体特异性与非特异性抗肿瘤免疫反应.