蛋白激酶Cα亚型在中国仓鼠卵巢上皮细胞中的表达

目的 研究中国仓鼠卵巢上皮(CHO)细胞是否表达蛋白激酶C(PKC)α亚型.方法 参照GenBank数据库PKCα亚型的cDNA序列,通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCα亚型的特异引物,RT-PCR扩增CHO细胞PKCα亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCα连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKC α亚型.结果 RT-PCR和Western blotting方法均表明CHO细胞表达PKCα亚型,并经测序证实.结论 CHO细胞中发现PKCα亚型的存在,为深入研究PKC α亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础.     

骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

【目的】克隆人骨形态发生蛋白(BMP4)基因,构建真核表达质粒,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,为进一步研究以BMP4进行骨修复的基因治疗奠定基础。【方法】采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,从人的松质骨中扩增BMP4的环形脱氧核糖核酸(cDNA),插入pGEM-Teasy载体,测序证实后,将其亚克隆至质粒PCDNA3.1B(-)中构建BMP4真核表达载体;采用脂质体将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,以RT-PCR和免疫组织化学方法鉴定转染细胞中BMP4基因的表达。【结果】经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和免疫组化方法证明转基因CHO细胞克隆中存在人BMP4基因。【结论】成功获得了人BMP4的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

【目的】研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB／c的表达情况。【方法】ES-BALB／c细胞株用普通ES细胞培养液培养，分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿，培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。【结果】免疫组化发现PKCα。在ES-BALB／c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达，以细胞浆和细胞核最甚，而PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达；Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带，分子质量约为84ku，而PKCβ、PKCγ，PKCδ和PKCε 4种亚型无蛋白印迹条带。【结论】PKCα在ES细胞阶段即有表达，在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用，而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

重组体pcDNA3．1（＋）－tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

【目的】克隆酪氨酸酶基因(tyr)，构建pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并导人NIH3T3细胞表达。【方法】用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3．1( )的T7启动子下游，并用脂质体法导入NIH3T3细胞，RT-PCR，酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。【结果】成功克隆1．74kb的全长tyr cDNA片段，经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致，tyr准确克隆人pcDNA3．1( )的多克隆位点，RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。【结论】本实验成功构建了pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并成功导入NTH3T细胞中表达.     

小鼠Neuronatin基因真核表达载体构建及其蛋白产物的检测

【目的】构建基因Nnat的真核表达载体pEGFP-N1/Nnat并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】RT-PCR法扩增Nnat基因编码区(ORF),利用基因克隆技术构建真核表达载体,酶切及测序进行鉴定;载体构建成功后转染HepG2细胞,观察融合蛋白在细胞中的定位,Western blot检测其在真核细胞中的表达。【结果】RT-PCR法扩增出Nnat基因的两种亚型,相应的双酶切能够获得插入的目的基因片断,测序分析未发现突变;荧光显微镜观察到两种融合蛋白在细胞中分布与EGFP明显不同,融合蛋白主要分布在细胞质中,细胞核中没有表达;Western blot结果可见两条明显的特异条带。【结论】小鼠Nnat基因真核表达载体构建成功,并能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF-C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF-C的生物学功能奠定基础.方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF-C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中.采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达.结论经RT-PCR扩增转染细胞cDNA和Western blotting检测证实重组质粒pcDNA3.1-VEGF-C能在宿主细胞中高效表达.     

肾癌G250抗原基因在sp2/0细胞中的表达及其意义

 【目的】将G250抗原cDNA片段转染入sp2/0细胞中并获得稳定表达,为G250基因疫苗研究提供实验工具。【方法】用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入sp2/0细胞中,经G418筛选得到稳定表达,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光、Western blot检测G250基因在sp2/0细胞中的表达。【结果】转染2周后,筛选出阳性sp2/0细胞克隆,通过RT-PCR证实有G250mRNA转录,间接免疫荧光可以见到阳性细胞,Western blot证实有G250抗原表达。【结论】建立了稳定表达G250抗原的肿瘤细胞模型,为研究基于肾癌G250基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。     

绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建具有绿色荧光蛋白报告 (GFP)基因的ZNF5 80真核表达载体 ,为转染细胞提供基础。【方法】根据ZNF5 80cDNA序列的开读框架设计上、下游引物 ,利用PCR技术扩增ZNF5 80cDNA开放阅读框序列 ,将PCR目的片段与PGEM T载体连接并克隆 ,酶切含目的片段PGEM T质粒及 pEGFP C1载体 ,回收纯化后做定向克隆连接 ,BglⅡ及HindⅢ双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】酶切 pEGFP C1 ZNF5 80 ,电泳分析插入片段长度为 :5 2 4bp ,与预期的结果一致 ,经连接点两端进行测序 ,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建真核表达载体pEGFP C1 ZNF5 80。     

VEGF—C真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达栽体，检测其在真核细胞CHO中的表达。方法：根据人VEGF—C cDNA的序列，设计合成一对特异性引物，用RT—PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF—C基因的cDNA，回收PCR产物连接于克隆载体。扩增，质粒提取，酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF—C cDNA全长的基因片段，与真核表达栽体pcDNA3．1(-)连接重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3．1(-)，VEGF-C转染至CHO细胞中，G418加压筛选培养。最后用Westerm—blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白。结果：基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长。重组peDNA3．1(-)中含 有VEGF—C cDNA全长序列，Westem—blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

小鼠烟酰胺N-甲基转移酶基因的克隆及其表达

目的 克隆和表达小鼠烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)基因.方法 设计特异引物,利用逆转录PCR克隆小鼠NNMT编码cDNA序列,并进行序列测定;然后通过PCR扩增,双酶切回收cDNA片段定向重组到载体pEGFP-N3中,采用PCR和酶切鉴定重组表达质粒;最后将其转染到真核细胞中,通过Western杂交检测其表达,用激光共聚焦显微镜检测其细胞分布.结果经RT-PCR获得了小鼠NNMT的编码cDNA序列,经测序证实克隆序列完全正确;PCR和酶切鉴定表明绿色荧光蛋白(GFP)标记的NNMT表达质粒pNNMT-GFP成功构建;转染至HEK293T细胞中,Western杂交检测到绿色荧光蛋白融合的NNMT特异表达,显微观察表明NNMT分布在细胞质中.结论成功构建了NNMT的表达质粒,并在小鼠中实现其表达.     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

重组表达载体IDO/pEGFP-C1的构建

【目的】构建表达IDO重组表达载体IDO/p EGFP-C1。【方法】RT-PCR扩增IDO c DNA,连接于表达载体p EGFP-C1,酶切鉴定及序列分析证实后将载体转染至TC-1细胞,RT-PCR和Western blotting实验观察IDOm RNA和蛋白表达。【结果】酶切鉴定及序列分析证实IDO成功连接于表达载体p EGFP-C1上,转染至TC-1细胞后可见IDOm RNA和蛋白表达。【结论】IDO重组表达载体IDO/p EGFP-C1构建成功。     

AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

目的:构建人蛋白激酶B相瓦作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIP cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过Western Blot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,Western Blot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

肾癌G250抗原基因在sp2/0细胞中的表达及其意义

【目的】将G250抗原cDNA片段转染入sp2/0细胞中并获得稳定表达,为G250基因疫苗研究提供实验工具。【方法】用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入sp2/0细胞中,经G418筛选得到稳定表达,采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、间接免疫荧光、Western blot检测G250基因在sp2/0细胞中的表达。【结果】转染2周后,筛选出阳性sp2/0细胞克隆,通过RT-PCR证实有G250mRNA转录,间接免疫荧光可以见到阳性细胞,Western blot证实有G250抗原表达。【结论】建立了稳定表达G250抗原的肿瘤细胞模型,为研究基于肾癌G250基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

小鼠BTLA胞外段腺相关病毒载体的构建和表达

目的 构建小鼠B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)胞外段的腺相关病毒载体,并感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR 扩增BTLA 胞外段,然后将其克隆到腺相关病毒载体的骨架质粒中,构建重组骨架质粒psBTLA.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,与pHELP质粒以及pRC质粒3质粒共转染293T细胞,收获含病毒的上清后用氯仿-PEG8000的方法进行纯化浓缩,再用浓缩后的病毒液感染CHO细胞,并用SDS-PAGE和Western blot检测BTLA胞外段的表达.结果 获得长度为502 bp的小鼠BTLA胞外段基因,经测序证实其序列正确.含有BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体感染CHO细胞后,SDS-PAGE和Western blot分析证实感染的CHO细胞可表达出约21 kD的BTLA胞外段蛋白.结论 成功构建小鼠BTLA胞外段基因的腺相关病毒载体,并感染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究BTLA胞外段的功能效应奠定实验基础.