鲨肝刺激物质类似物cDNA片段的克隆及序列分析

目的：从鲨鱼肝脏中分离纯化肝刺激物质，测定N-端氨基酸残基序列，根据序列分析结果，合成简并引物，获得鲨鱼肝刺激物质的cDNA序列，并对其进行序列分析，比较其与已报道序列的同源性。方法与结果：通过离子交换和凝胶过滤层析方法，从鲨鱼再生肝组织中分离到一种可刺激肝癌细胞株SMMC-7721增殖活性的多肽，命名为鲨鱼肝刺激物质(sHSS)。进一步通过FPLC Mono Q柱纯化后，纯度可达95％以上，其得率为40mg／kg肝脏，SDS-PAGE分析表明：sHSS的分子量约为16000Da。对sHSS的氨基酸组分及n-端氨基酸序列进行了分析，并根据其N-端氨基酸残基序列设计了一套简并引物，利用RT-PCR方法从再生肝组织的总RNA中扩增到一大小为504bp的cDNA片段，序列分析表明其与我们分离到的天然鲨肝刺激物质有一定的差异，而与已报道的肝再生增强因子(ALR)差异较大，而与人、鼠以及果蝇中的一种未知功能的蛋白质在氨基酸水平上的同源性较高，分别为84％，83％和57％，这类物质可能在生物机体中发挥重要的生理功能。结论：通过RT-PCR扩增，获得了鲨肝刺激物质类似物的cDNA片段。     

鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性研究

 目的 研究鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性。方法 根据从鲨鱼肝脏中分离纯化到的S-8300的N端氨基酸序列,设计了一套简并引物,利用RT-PCR方法从再生鲨肝组织的总RNA中扩增到一条cDNA片段,大小为342 bp。结果 根据序列分析及氨基酸序列推测的结果,表明这个cDNA片段的N端与S-8300 N端15个氨基酸序列完全一致,gene bank 和NCBI的搜索结果表明这个cDNA片段是一个新的序列。将这个cDNA片段插入到信号肽pelB基因下游,成功构建了原核分泌表达质粒pET22b-S,将该质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中成功构建了工程菌pET22b-S/BL21(DE3)。通过对重组菌诱导条件（诱导温度、诱导剂IPTG的浓度）的筛选,SDS-PAGE分析,结果表明,在25 ℃,0.4 mmol·L-1 IPTG诱导条件下,rS-8300在信号肽pelB引导下能够高效的分泌至周质腔中。结论 活性研究表明,该分泌表达产物具有与天然S-8300相似的减轻链脲霉素对NIT-1细胞损伤的作用。     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

牛环孢素A结合蛋白B基因的克隆与鉴定

目的：克隆牛环孢素A结合蛋白B（Cyclophilin B，CyPB）基因的cDNA序列，进行序列测定和分析，比较序列同源性。方法：利用表达序列标签（expressed sequencetag，EST）重叠序列拼排技术，设计特异性CyPB引物，分别以牛的各种组织的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，将PCR产物纯化，连接于pGEM—T载体，进行DNA序列测定、数据库检索及分子生物学软件分析。结果：成功克隆了牛CyPB（bCyPB）的cDNA序列，经BLAST查新检索证实为新基因，提交Genbank数据库并被收录，登录号分别为AY594336。比较克隆新基因与人CyPB基因（hCyPB）的cDNA序列及推导的氨基酸序列同源性，编码区序列及氨基酸序列同源性均高达91％。结论：分析比较证实CyPB基因在物种间高度保守，为利用牛的CyP蛋白提供了依据，实验建立了利用生物信息途径进行计算机克隆新基因和利用分子生物学技术RT-PCR获得新基因的技术路线和方法。     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

天花粉蛋白突变体的构建及其与重组天花粉在原核系统中的表达和纯化

目的:对天花粉蛋白(TCS)的第120-123位氨基酸进行缺失突变,并在原核系统中对其进行表达和纯化。方法:利用重叠延伸PCR的方法得到TCS突变体cDNA,并克隆入原核表达载体pET-28(a+)。酶切和测序鉴定后,将突变体质粒pET-28(a+)-mTCS转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导表达后,对表达产物用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化和Western-blot鉴定。结果:利用重叠延伸PCR成功获得突变天花粉蛋白的编码序列,并构建pET-28(a+)-mTCS原核表达质粒。在BL21(DE3)菌中,突变体蛋白(mTCS)可被IPTG诱导性表达,并被Ni2+-NTA树脂有效纯化。结论:本实验成功获得一种突变体TCS,并建立该突变TCS的原核表达和纯化的实验方法。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因克隆与原核表达分析＊

目的 克隆霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因并进行生物信息学分析，为进一步培育高黄酮含量的霍山石斛药材提供理论依据。方法 根据前期霍山石斛转录组数据筛选出的基因DhUF3GT，克隆该基因，并对cDNA的核酸序列进行生物信息学分析，同时构建DhUF3GT-pET28（a）重组质粒进行原核表达分析。结果 测序结果显示，霍山石斛DhUF3GT基因cDNA序列有1289 bp，包含一个长度为1239 bp的开放阅读框，编码412个氨基酸，GenBank中的登录号为OM460827。生物信息学分析表明：DhUF3GT蛋白属于亲水性稳定蛋白，理论相对分子质量为45.668 KD，等电点（PI）为5.98，具有多个磷酸化位点和两个糖基化位点，不含信号肽，亚细胞定位于叶绿体。系统进化树表明，该序列与同科植物铁皮石斛同源性最高，具有UGT家族的“PSPG Box”保守区域。SDS-PAGE电泳显示，成功表达出原核重组蛋白DhUF3GT-pET28（a）。结论 成功克隆出霍山石斛DhUF3GT基因序列，并获得其序列特征及原核表达蛋白，这有助于霍山石斛DhUF3GT功能的进一步研究及类黄酮化合物的生物合成机制的阐明。     

怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析

目的 对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶(Rehmannia glutinosaf hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT)cDNA 全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据.方法 根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对:利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达.结果 RghK AT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框(ORF),编码464个氨基酸:同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84％、82％、82％、79％、73％; RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88％、88％、86％、87％、78％:各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKAT mRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达最强,而在幼苗期叶中表达量最低.结论 成功克隆了RghKAT cDNA 全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量最高.     

蛇足石杉HsCAO2基因的克隆、生物信息学分析及载体构建

目的 为筛选高活性的蛇足石杉铜胺氧化酶（copper-containing amine oxidase,CAO）,通过生物工程方法实现石杉碱甲（huperzine A,HupA）的合成、为加快新药创制进度提供理论依据。方法 基于蛇足石杉转录组测序得到的CAO序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术,扩增、拼接并验证获得该基因的全长cDNA序列,并将其命名为HsCAO2。结果 通过RACE技术得到HsCAO2的cDNA全长为2696 bp,CDS为2199 bp,编码732个氨基酸。氨基酸序列同源性比对发现,HsCAO2具有保守的氨基酸位点和Cu²⁺结合位点;进化树分析结果表明,HsCAO2与蛇足石杉中的另一个CAO（HsCAO1）同源性最高,达91.67%;蛋白质结构分析结果表明,HsCAO2也可能在生物体里以同源二聚体的形式存在。在此基础上,进一步分别构建了超表达载体pOX-HsCAO2和体外蛋白表达载体pET-28a （+）-HsCAO2。结论 HsCAO2很可能是蛇足石杉中的一个新的功能性CAO,且超表达载体和体外蛋白表达载体的成功构建为进一步研究其功能奠定了基础。     

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达

目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin(Pl Actin)基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a(+)-Pl Actin,转化BL21(DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4~0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a(+)-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。     

北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达

目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白。方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的c DNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白。结果:得到北葶苈子GGPS c DNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系最近;成功构建了p ET-32a-La GGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达。结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础。     

桑黄HMGS基因克隆、分子特性及差异表达分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryCoAsynthase,HMGS)进行基因全长克隆、分子特性及差异表达分析研究。方法采用RACE技术克隆HMGS基因全长,并对其序列进行生物信息学分析;构建桑黄HMGS基因到表达载体pET-32a (+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测;用荧光定量PCR的方法分析其不同发育阶段表达特性。结果 HMGS基因cDNA全长为1 930 bp,包含1个1 458 bp的完整开放阅读框,编码485个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量约为52 750,理论等电点是5.60,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列;系统发育分析表明,桑黄HMGS与地中海拟层孔菌Fomitiporia mediterranea中的HMGS同源性最高,属于一个分支。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小与预测的蛋白相对分子质量基本一致。HMGS基因的转录水平在桑黄不同发育阶段呈动态变化,该基因在菌丝体阶段的转录水平要高于原基及子实体阶段的转录水平。HMGS基因的最高转录水平出现在第14天,为对照第5天的2.33倍。结论 HMGS基因的分子鉴定为进一步解析该基因在桑黄三萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础。     

地黄RgGGPPS2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

目的为了研究地黄萜类化合物生物合成途径的功能基因,从地黄中克隆了一条新的地黄GGPPS基因(RgGGPPS2),进行生物信息学分析,原核表达、纯化以及基因表达模式分析。方法根据地黄转录组数据中RgGGPPS2基因的序列信息,设计特异性引物,克隆了RgGGPPS2基因的开放阅读框(ORF)序列,构建pET32a-RgGGPPS2原核表达载体,用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达RgGGPPS2重组蛋白,荧光定量PCR检测RgGGPPS2基因的组织特异性表达。结果 RgGGPPS2基因的ORF为867 bp,编码289个氨基酸。生物信息学分析结果发现RgGGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序FARM(first aspartate-rich motif)和SARM(second aspartate-rich motif),RgGGPPS2与芝麻、长春花等双子叶植物中GGPPS蛋白的同源性较高。通过构建pET-32a-RgGGPPS2原核表达载体在大肠杆菌中成功表达RgGGPPS2重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的RgGGPPS2重组蛋白。荧光定量PCR结果显示RgGGPPS2基因在根中表达量最高,其次是叶,茎中最低。结论克隆了RgGGPPS2基因,获得了纯化的RgGGPPS2重组蛋白,为研究RgGGPPS2基因在地黄萜类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

人参中核黄素激酶基因的克隆与原核表达

目的从人参中克隆出核黄素激酶基因,进行相关的生物信息学分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌诱导表达。方法根据人参转录组数据库筛选出序列comp61599_c0_seq12,经相关软件对其进行序列分析;该序列3’末端缺失,利用3’RACE技术获得3’端序列;通过PCR技术获得人参核黄素激酶基因的全长c DNA序列,并构建原核表达载体p ET-32a-Pg RFK,通过热激法转化到大肠杆菌BL-21中进行诱导表达。结果从人参中成功克隆出1条长度为1 200 bp的核黄素激酶基因,其编码399个氨基酸,同时成功构建该基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白大小与预测蛋白相对分子质量一致。结论成功克隆了人参核黄素激酶基因,并在大肠杆菌中成功表达。