唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)是二萜类物质合成途径中的一个关键酶。该文采用生物信息学方法对9种唇形科植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的核苷酸及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性和亚细胞定位特征、二级结构、蛋白质功能域、三级结构和进化关系进行了初步预测和分析,并构建了牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶蛋白家族的系统进化树。结果表明,9种唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性质基本一致,主要表现为亲水性蛋白,有叶绿体转运肽,不存在信号肽,没有跨膜结构域;大多数定位于叶绿体,少数定位于线粒体。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域。研究结果将为GGPS的酶学特性及二萜类生物合成的分子机制研究提供理论参考。     

马蓝等79种植物分支酸合成酶的生物信息学分析

分支酸合成酶(chorismate synthase,CS,EC:4.2.3.5)催化5-烯醇式莽草酸-3-磷酸生成分支酸,是生物体内分支酸合成所必须的酶。目前,Genbank报道了79种高等植物CS的氨基酸序列。该研究采用生物信息学方法对马蓝等79种植物共125条CS氨基酸序列的组成成分、信号肽、导肽、疏水性/亲水性、跨膜结构、卷曲螺旋结构、蛋白二级结构、三级结构及其功能域等进行预测和分析,并构建了CS蛋白家族的系统进化树。进化分析结果表明这79种植物的CS被分为8个类群;而氨基酸序列同源性比对结果显示,马蓝CS的氨基酸序列与芝麻、烟草、马铃薯等植物的同源性比较高。所有植物CS的开放阅读框在1 300 bp左右,相对分子质量为50 k Da左右,等电点(p I)在5.0~8.0,呈微碱性。该研究克隆得到的马蓝CS的开放阅读框为1 326 bp,氨基酸残基数为442个,相对分子质量47 k Da,等电点(p I)为8.11。CS氨基酸肽链表现出明显的疏水区和亲水区,不存在信号肽,可能存在跨膜结构域。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是无规则卷曲和α-螺旋,并含有活性结构域、PLN02754保守域和FMN结合位点3个主要的组成结构域。研究所获得的结构信息,可为今后进一步深入研究植物CS的构效关系和结构改造提供一定的科学依据。     

马蓝等79种植物分支酸合成酶的生物信息学分析北大核心CSCD

分支酸合成酶（ehorismate synthase,CS,EC：4．2．3．5）催化5-烯醇式莽草酸-3-磷酸生成分支酸,是生物体内分支酸合成所必须的酶。目前,Genbank报道了79种高等植物cS的氨基酸序列。该研究采用生物信息学方法对马蓝等79种植物共125条cs氨基酸序列的组成成分、信号肽、导肽、疏水性／亲水性、跨膜结构、卷曲螺旋结构、蛋白二级结构、三级结构及其功能域等进行预测和分析,并构建了cs蛋白家族的系统进化树。进化分析结果表明这79种植物的cs被分为8个类群;而氨基酸序列同源性比对结果显示,马蓝cs的氨基酸序列与芝麻、烟草、马铃薯等植物的同源性比较高。所有植物cs的开放阅读框在1300bp左右,相对分子质量为50kDa左右,等电点（pI）在5．0-8．0,呈微碱性。该研究克隆得到的马蓝cs的开放阅读框为1326bp,氨基酸残基数为442个,相对分子质量47kDa,等电点（pI）为8．11。CS氨基酸肽链表现出明显的疏水区和亲水区,不存在信号肽,可能存在跨膜结构域。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是无规则卷曲和d．螺旋,并含有活性结构域、PLN02754保守域和FMN结合位点3个主要的组成结构域。研究所获得的结构信息,可为今后进一步深入研究植物cs的构效关系和结构改造提供一定的科学依据。     

丹参柯巴基焦磷酸合酶的生物信息学分析

目的分析丹参柯巴基焦磷酸合酶(CPS)的氨基酸序列特征,并与其他植物进行比较,为丹参CPS蛋白的后续研究提供有利参考。方法利用生物信息学方法,以丹参为主,对13科16种植物的18条CPS蛋白序列进行了序列组成、生化特性、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级、三级结构及功能域等预测分析,并进行了丹参CPS蛋白序列与其他植物的同源比对以及系统进化树构建。结果 CPS蛋白氨基酸残基数集中在730以上;相对分子质量91 610左右;平均理论等电点5.87,提示CPS为酸性蛋白。序列结构预测结果显示,CPS蛋白具有明显的疏水区和亲水区,不存在信号肽,不具有跨膜结构域,可能有叶绿体转运肽。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲。蛋白同源性比对结果显示,丹参CPS与同科植物迷迭香和玄参科植物野甘草的同源性最高。结论对丹参等植物的CPS蛋白进行了详细的生物信息学分析,可为今后深入研究该酶的结构特征和功能提供参考。     

水母毒素的分离提取及溶血活性研究

目的 研究水母毒素的提取及其溶血活性的影响因素。方法通过缓冲溶液浸取、超声波细胞破碎等操作从水母触手的刺丝囊中提取毒素，采用分光光度法对水母毒素的溶血活性进行测定，并研究了温度、浓度和二价金属离子等因素对毒素溶血活性的影响。结果水母毒素的溶血活性对温度敏感，随着浓度的提高而增大，并且依赖于Ca^2＋，Mg^2＋等二价金属离子的存在。结论水母毒素具有较强的溶血活性，但不稳定。     

TLR4基因结构和功能的生物信息学分析

目的运用生物信息学的各种方法,对TLR4基因的结构和功能进行深入分析。方法依托生物信息学的各种软件,对TLR4基因启动子及其所编码的氨基酸理化性质、信号肽、跨膜结构、蛋白质的二级结构、蛋白质三级结构、蛋白质翻译后修饰、蛋白质相互作用进行生物信息学分析。结果 TLR4基因只有一个启动子;TLR4蛋白属于亲水的不稳定蛋白,等电点为5.88;TLR4蛋白大多数位于膜外的分泌蛋白并且有信号肽;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;三级结构稳定可靠;N-糖基化位点和O-糖基化位点各有10和4位;磷酸化的位点有Ser:21,Thr:6,Tyr:7;TLR4蛋白可以与10个蛋白发生作用。结论深入分析TLR4基因的结构和功能,研究其与肝脏疾病之间的关系有很大的意义。     

唇形科8种药用植物漆酶基因的发现与生物信息学分析

目的分析漆酶在唇形科药用植物中的异同,以期为唇形科药用植物中漆酶的后续研究提供依据。方法通过生物信息学方法从唇形科8种药用植物的转录组数据库中发掘了 31个完整漆酶基因并解析其特征,包括序列的同源性、理化特征、信号肽、导肽、跨膜结构域、糖基化与磷酸化位点、二级结构和铜离子结构域等,并对它们的进化关系以及表达模式进行了初步分析。结果唇形科药用植物漆酶基因均具有典型的漆酶结构特征,相对分子质量在62 000左右,多数含有分泌途径的信号肽,无规则卷曲和延伸链是其二级结构的主要构成部分;通过与拟南芥Arabidopsis thaliana和丹参Salvia mitiorrhiza漆酶共同构建系统进化树,能将其分为7个亚族。结论对唇形科药用植物漆酶基因的详细分析,可为后续该酶基因的深入研究以及通过生物技术手段对唇形科药用植物药效物质进行代谢调控以及关键酶基因的定点突变提供参考信息。     

基于转录组信息的甘松MADS-box转录因子家族分析

目的 基于转录组数据筛选鉴定分析甘松Nardostachys jatamansi MADS-box转录因子家族。方法 利用生物信息学的方法全面分析甘松MADS-box基因家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、基因结构、导肽、信号肽及跨膜结构域、系统进化树。结果 在甘松转录组数据中共鉴定出20个MADS-box转录因子,含有90～365个氨基酸,相对分子质量在10 179.96～41 707.68,理论等电点范围为4.87～10.43,主要在细胞核表达,均含有MADS保守结构域,均不含信号肽、导肽以及跨膜结构域。系统发育分析表明甘松MADS蛋白主要属于TypeII型。结论 利用生物信息学分析手段,鉴定了甘松MADS-box家族转录因子,为甘松深入研究甘松MADS-box蛋白的生物学功能提供参考,为甘松的药用成分合成调控机制提供研究基础,为培育优质甘松新品种提供依据。     

桔梗PgHMGS和PgHMGR基因克隆与原核表达分析

目的 从桔梗植物的根中克隆羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因,并进行生物信息学及原核表达分析。方法 依据桔梗转录组数据中筛选的基因序列信息,通过RT-PCR从桔梗根中克隆得到桔梗PgHMGS和PgHMGR基因;通过生物信息学分析软件预测PgHMGS和PgHMGR的蛋白性质,构建蛋白的三级结构模型,进行系统进化分析;构建重组表达载体pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR,在Ecoli.BL21(DE3)中诱导表达。结果 克隆获得的PgHMGS、PgHMGR ORF长度分别为1 401、1 749 bp,分别编码466、582个氨基酸。通过在线软件预测PgHMGS、PgHMGR分别定位于线粒体膜和内质网,均为酸性蛋白。二级结构预测结果显示PgHMGS、PgHMGR主要由α-螺旋组成。跨膜结构域预测PgHMGS不包含跨膜结构域,PgHMGR在54～76、96～118 aa分别有两个跨膜结构域。结构功能域分析PgHMGS的4～466 aa具有PLN02577(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)家族的保守结构域,PgHM...     

20种中药基原植物鲨烯合酶基因的生物信息学分析

目的鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)是三萜化合物合成途径中的关键限速酶,对其蛋白特性进行分析与预测。方法利用生物信息学相关分析工具对20种《中国药典》2015年版收录中药基原植物SQS的理化性质、结构特征及功能特点进行分析。结果20种中药基原植物有关各条SQS氨基酸序列,其在氨基酸长度、氨基酸组成、相对分子质量及平均亲水系数方面基本一致;所有的SQS均未发现信号肽;二级结构具有明显的一致性,并且α-螺旋和无规则卷曲是主要的结构元件;所有SQS蛋白均含有4个高度保守的结构域和在氨基酸的C端有1~2个跨膜结构;系统进化树结果与植物系统分类学结果基本一致。结论这20种中药基原植物的SQS的特性差别不大,进化距离也比较近,显示SQS具有较高的保守性和稳定性。分析结果为SQS的功能和作用机制研究提供依据。     

丹参转录因子SmWRKY14基因的克隆及表达分析

目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14,分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法 以丹参转录组数据中Unigene（c50007_g1）序列为参考,利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征,采用DNAMAN和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建,运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果 克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长1 103 bp,编码244个氨基酸,相对分子质量27 600,等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序,不含信号肽及跨膜结构域,其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达,且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似,且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论 获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征,为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。     

新疆紫草AP2/ERF转录因子的电子克隆和生物信息学分析

应用电子克隆技术,以紫草AP2/ERF序列为探针,获得了新疆紫草的1条876 bp AP2/ERF的序列,包含1个1 077 bp的开放阅读框编码205个氨基酸,命名为AeAP2/ERF。采用生物信息学方法,对该基因所编码的蛋白从氨基酸组成、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、疏水性/亲水性、高级结构及功能域等方面进行预测和分析,结果显示该基因编码蛋白定位于细胞核,为水溶性蛋白,可以调控代谢、转导信号。     

人参多向耐药性转运蛋白基因保守区序列的克隆及分析

目的 对人参多向耐药性(PDR)转运蛋白基因进行克隆及序列分析.方法 利用其他植物PDR基因的保守区域设计简并引物,以人参根总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增人参PDR基因片段并连接至pGEM-T Easy载体上,阳性克隆经PCR检测后测序.结果 得到一段长693 bp的基因序列,序列分析表明,该片段编码231个氨基酸,与植物PDR基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在76％和80％以上.分析表明该序列属于PDR转运蛋白的核苷酸结合域,具有PDR转运蛋白的C端Walker A、ABC标签模体和C端walker B 3个保守功能域.结论 首次从人参中克隆出PDR转运蛋白基因,为研究人参次生代谢产物的转运和积累机制奠定了基础.     

刺五加Actin 基因cDNA 全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin 基因保守序列设计引物,利用套式PCR 进行3' 和5'RACE 扩增,得到Actin 基因的3' 和5' 端cDNA 序列片段,拼接获得cDNA 全长。将该序列进行BLAST 比对、相似度分析,并对刺五加Actin1 蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin 基因全长1 507 bp,命名为ESActin1,注册号KC469585 。该基因开放阅读框（ORF）长1 134 bp,编码377 个氨基酸,5' 端非编码区长140 bp,3' 端非编码区长233 bp。ESActin1 与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上,蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

蟾蜍TNFRSF11b、TNFRSF9基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆中华蟾蜍肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的全长序列,并分析其序列特征。方法 根据转录组测序所得的TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段设计特异性引物,以中华蟾蜍蟾皮为材料,利用逆转录聚合酶链式反应（PCR）技术获得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR方法检测BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在中华蟾蜍7种组织/器官中的表达情况。结果 克隆获得蟾蜍BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA序列为1233 bp,编码410个氨基酸,理论相对分子质量为46.97 kDa,等电点为8.64,不存在跨膜区及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。BbgTNFRSF9基因的全长cDNA序列为829 bp,编码247个氨基酸,理论相对分子质量为67.874 kDa,理论等电点为5.12,存在信号肽,为疏水性蛋白,具有多个磷酸化位点,进化树分析发现BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因与其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9基因相似度不高,表明该基因虽有特殊结构域但不同物种间差异较大。组织表达分析显示,BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达显著高于其他部位。结论 成功获得蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列,掌握其序列特征,为后续深入研究该蛋白的功能提供参考。     

金环蛇蛇毒中的一种新型胰蛋白酶抑制剂

目的从金环蛇蛇毒中分离纯化名为bungaruskunin 1的一种新型胰蛋白酶抑制剂,并从其毒腺的cDNA文库中克隆出该胰蛋白酶抑制剂的cDNA全序列.方法通过Sephadex G-50, CM-Sephadex C-25, HPLC, RP-HPLC (C4 column)方法分离纯化bungaruskunin 1.样品的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性则是在室温条件下50mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.8的缓冲液中通过对显色底物的水解抑制作用来检测的.金环蛇毒腺RNA用TRIZOL提取,并用SMARTM PCR cDNA synthesis kit (Clontech)建成cDNA文库.根据其信号肽的保守区域合成引物从该文库中扩增出bungaruskunin 1的cDNA全序列,进行胶回收,酶连到pMDl8-T载体中转化测序.结果bungaruskunin 1的前体由83个氨基酸组成,其中信号肽含有24个氨基酸,成熟肽即bungaruskunin 1合有59个氨基酸.bungaruskunin 1的cDNA序列与从红腹伊澳蛇Pseudechis porphyriacus中分离纯化得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂blackelin的cDNA序列的相似性高达64%.bungaruskunin 1是一种含有保守Kunitz端的Kuntiz蛋白酶抑制剂家族的一员,从而能够抑制蛋白酶和弹性酶的活性.在cDNA文库中,我们同时还筛选到了2种新的β-bungarotoxin B链的序列.结论这些发现很好地证明了蛇中Kunitz/BPTI胰蛋白酶抑制剂和毒性神经的家族可能起源于共同的祖先.     

铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析

锌铁调控转运蛋白(ZRT, IRT-like protein, ZIP)在植物生长发育过程中起重要的调控作用。研究采用实时定量PCR(QPCR)和RACE技术,首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到1个ZIP基因cDNA全长,命名为DoZIP1,提交GenBank获得注册号KJ946203。生物信息学分析显示,该基因开放阅读框1 056 bp,编码1条由351个氨基酸组成的肽链,相对分子质量37.57 kDa,等电点6.09。推定的DoZIP1蛋白具有保守的锌铁调控转运相关蛋白结构域,二级结构包含α螺旋50.71%、延伸链11.11%、β转角1.99%与随机卷曲36.18%,具有信号肽和8个跨膜域,预测定位在质膜。该蛋白质氨基酸序列与拟南芥、苜蓿、水稻等物种ZIP蛋白相似性较高,系统进化分析表明其与AtZIP10,OsZIP3蛋白的亲缘关系较近,聚在一个分支。QPCR分析表明,DoZIP1基因转录本在根中相对表达量较高,为茎中的4.19倍;叶次之,为茎的1.12倍。DoZIP1基因的分子特征为下一步研究其在铁皮石斛生长发育过程的生物学功能奠定基础。     

刺五加Actin基因cDNA全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Aetin基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。方法i以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin基因保守序列设计引物,利用套式PCR进行3’和5＇RACE扩增,得到Aetin基因的3’和5’端cDNA序列片段,拼接获得cDNA全长。将该序列进行BLAST比对、相似度分析,并对刺五加Aetinl蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Aetin基因全长1507bp,命名为ESActinl,注册号KC469585。该基因开放阅读框（ORF）长1134bp,编码377个氨基酸,5’端非编码区长140bp,3’端非编码区长233bp。ESAetin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75％以上,蛋白质序列的相似性在94％以上。结论：首次报道了刺五加Actin基因的全长cDNA序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。