hTPO和hNIS共转染提高人胶质瘤、肺癌及甲状腺癌细胞摄放射性碘能力

目的 研究共转染人甲状腺过氧化物酶基因（hTPO）及人钠碘转运体基因（hNIS）后胶质瘤、肺癌及甲状腺癌细胞的摄碘能力变化。方法 克隆,重组,包装并扩增纯化得到重组腺病毒（AdTPO）,测定病毒滴度。使用脂质体转染法将hNIS基因转染入人胶质瘤、肺癌及甲状腺癌细胞系中,经过G418抗生素筛选获得稳定表达hNIS的细胞系,只转染hNIS基因的细胞系为对照组;使用重组腺病毒将hTPO基因转导入对照组中,共转染hNIS及hTPO基因的细胞系为实验组;未转入hTPO和hNIS基因的原始肿瘤细胞系为空白对照组。然后进行3组细胞系的体外摄125I 率及各细胞系的125I外流实验。结果 在各肿瘤细胞系中,实验组细胞的摄碘率和有效半衰期,较对照组细胞和空白对照组细胞均有所提高,实验组细胞的摄碘率：H460组为59628 1281,U251组为7968 1261,ARO组为52971 2162,FRO组为49638 1281,三组间总体具有统计学差异（P<0.01）。结论 将hTPO和hNIS基因共转染至肿瘤后,能有效提高肿瘤的摄碘能力并延长细胞内碘滞留时间。     

hTERT核心启动子调控的hNIS重组腺病毒的构建与鉴定

目的：构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子调控的人钠碘转运体（hNIS）基因重组腺病毒,并初步鉴定。方法：将hTERT核心启动子从hTERT/pcDNA3.1（＋）质粒中切出,亚克隆至含全长hNIS cDNA序列的质粒载体FL＊-hNIS/pcDNA3,应用限制性内切酶将hTERT-hNIS片段切出后连入穿梭质粒载体pAdTrack,应用AdEasy系统构建出重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS。同时,构建CMV启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV-hNIS作为阳性对照。应用RT-PCR方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性。结果：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS并经PCR验证正确。RT-PCR证实hNIScDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来。结论：成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS;hTERT核心启动子在转染的肺癌A549细胞中具有转录活性。为下一步的碘治疗实验提供了实验依据。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

NIS基因转染对肝细胞癌NIS蛋白表达及摄碘功能的影响

目的:探讨肝细胞癌细胞核素靶向治疗方法。方法:提取NIS基因片段并构建重组质粒pcDNA3/NIS,将重组质粒导入肝细胞癌HepG2细胞。转染后24 h利用Western-Blot法检测HepG2细胞NIS蛋白表达,采用125I结合试验评估转染后细胞的摄碘率,采用DAPI染色法评估HepG2细胞摄125I后的凋亡情况。实验组与对照组之间NIS蛋白表达、摄碘率以及细胞凋亡率比较采用t检验。结果:蛋白电泳表明经NIS基因转染后,实验组HepG2细胞已表达NIS蛋白,表达强度显著高于对照组（t=2.693, P<0.05）。实验组HepG2细胞摄碘率B/T%平均为（18.4±5.8）%,显著高于对照组（t=36.842, P<0.05）。结合125I后24 h,实验组凋亡细胞数多于对照组,平均凋亡率为（19.2±5.3）%,显著高于对照组（t=3.086, P<0.05）。结论:转染外源性NIS基因可上调肝细胞癌HepG2细胞NIS蛋白表达,使其具备摄碘功能,加快细胞凋亡,为放射性碘靶向治疗提供实验依据。     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

人TH基因重组腺病毒的构建及生物学活性研究

将人酪氨酸羟化酶cDNA表达盒克隆于质粒型腺病毒载体p△Elsp1A，得到重组质粒pAd－TH。随后用脂质体法将重组质粒pAd－TH和拯救型腺病毒质粒pBHG11一起共转染293细胞，通过体内同源重组生成重组腺病毒AdCMVth，THcDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。采用形态学、病毒核酸酶切和PCR／RT－PCR等方法进行鉴定正确。重组腺病毒滴度达到1010pfu／ml。初步结果表明，该重组腺病毒感染MN9D细胞后可使细胞内多巴胺水平增加1倍，显示出明显的TH生物学活性。提示TH重组腺病毒AdCMVth可作为高效的基因转移载体用于帕金森氏病基因治疗。     

携带野生型PTEN基因的腺病毒载体的构建

目的 构建携带野生型PFEN(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PFEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PFEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Western blot检测靶细胞内PFEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PFEN基因的腺病毒载体。     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染HEK293T细胞包装病毒。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达。结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400bp插入片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×108pfu/mL;重组病毒感染后,HEK293T细胞中IL-16 mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。     

小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建

从携带有全长人类 MDR1c DNA的质粒 p Ha MDR1- 1获得 MDR1基因片段 ,将其反向克隆到腺病毒载体 Ad Easy系统的穿梭质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装生成携带反义 MDR1基因片段的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- as MDR1,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究逆转肝癌多药耐药性的机制提供了基础     

Flag与GFP双标记人微粒体甘油三酯转移蛋白重组腺病毒载体的构建与表达

目的利用重组腺病毒（adenovirus，ad）技术Adeasy系统构建带绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）和Flag双标记的人类微粒体甘油三酯转移蛋白（human microsomal triglyceride transfer protein，hMTP）基因重组腺病毒载体，并包装成高滴度的腺病毒。方法自人HepG2细胞获得RNA，以RT-PCR和Nested PCR扩增hMTP-flag基因。PCR产物经测序证实后插入穿梭质粒GFP-Track。经PmeⅠ酶切线性化后，共转化到含腺病毒骨架质粒Adeasy的感受态细菌BJ5183。筛取阳性克隆，经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞，产生包装病毒颗粒，并传代扩增培养。结果经测序证实得到hMTP-flag-GFP基因，限制性内切酶证实同源重组腺病毒包含目的基因。荧光显微镜下可见GFP的高效表达，Western-blot检测可见97KD目的条带（hMTP分子质量为97KD）。结论成功构建含hMTP-flag-GFP基因的双标记重组腺病毒载体，并进行蛋白质表达，为进一步研究脂蛋白的功能打好了坚实基础。     

含人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1重组腺病毒的构建与体外表达

从人肝癌组织中提取总RNA，RT—PCR合成hTIMP-1的全长cDNA，克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTraek—CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183受体菌中进行同源重组，成功构建含hTIMP-1全长eDNA的重组腺病毒载体，经293细胞的包装、扩增，生成含hTIMP-1基因的重组腺病毒AdhTIMP-1并实现体外表达，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及肝癌的基因治疗提供实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因重组腺病毒的构建及在HepG2细胞中的表达

从携带有双拷贝乙肝病毒adw亚型全基因组的质粒pecob6获得X基因片段,将其亚克隆到AdEasy腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-X,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad-X,Ad-X可感染HepG2细胞,Western-blot法检测到X蛋白的表达,重组腺病毒Ad-X构建成功,为进一步研究X蛋白的生物学功能奠定了基础。     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

重组腺病毒载体转染Apo~(E-/-)小鼠的安全性评价和在主动脉血管组织的表达情况

腺病毒介导的脂联素过表达对Apo E-/-小鼠动物的安全性检测。将48只普通饮食饲养的12周龄雄性Apo E-/-小鼠分为对照组和脂联素干预组,每组24只。对照组给予一次性尾静脉注射生理盐水100μl;干预组则同法注射100μl重组腺病毒(Ad-APN-e GFP,3.0×108p.f.u)。分别在注射后0天、1周、2周、及4周处死小鼠,取全血和主动脉血管组织。用ELISA法测定血清中脂联素浓度;用WB法检测血管组织中标识绿色荧光蛋白(GFP)以确定重组腺病毒的转染率。全自动生化仪检测血常规指标、肝功能(ALT、AST)、肾功能指标(CR、BUN)、心肌酶(CK、CKMB)、以确定重组腺病毒转染的安全性。腺病毒对血常规指标和心肌酶的表达没有显著影响,对肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)(1周时组间差异P0.01和2周时组间差异P0.05)、肾功能指标尿素氮BUN(1周时组间差异P0.01)有一过性影响。重组腺病毒可在体内高效介导外源基因脂联素的表达,血清中的脂联素浓度在病毒转染后1周达到了最高值,约是正常对照组的4倍(78.28±15.02 vs 23.42±5.35)μg/ml,2周内稳定表达。1周时GFP蛋白在血管组织中表达的量最高,1周时GFP/GAPDH为83.63±1.50%,随后逐渐降低,2周时GFP/GAPDH为54.00±4.00%,4周时GFP/GAPDH为22.00±3.99%。重组腺病毒注射存在一过性的肝毒性和肾毒性,但是对动物的生理状态没有显著影响。重组腺病毒对Apo E-/-小鼠的血管组织有高效转染、2周内安全、稳定表达的特性。     

pAd-SIG腺病毒质粒构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的含人生长抑素受体2亚型(human somatostatin receptor subtype2,hSSTr2)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒重组质粒的构建及表达。方法采用PCR方法将hSSTr2以及IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,获得pShuttle-CMV/hSSTr2-EGFP,经PmeⅠ酶切,去磷酸化后转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183菌,细菌内同源重组构建腺病毒质粒pAdeasy-1/hSSTr2-EGFP(pAd-SIG),将其转染HEK293细胞进行病毒包装与滴度测定。重组腺病毒感染MCF-7细胞,流式细胞术检测其表达。结果酶切、PCR及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd-SIG构建成功,病毒滴度为8.2×109IU/ml,流式细胞术结果显示hSSTr2在MCF-7细胞中表达阳性率为86.59%。结论成功构建了重组腺病毒质粒pAd-SIG,并能在真核细胞表达,为体内外研究hSSTr2效应提供了基础。     

气管内吸入IL-12重组腺病毒对实验性肺转移癌的治疗作用

为研究气道内应用IL 12重组腺病毒 (AdIL 12 )对实验性肺转移癌的治疗作用。我们在小鼠气管内滴入AdIL 12 ,以ELISA法测定局部及外周血IL 12及相关因子水平 ,在C5 7BL/ 6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌 3LL细胞建立肺转移癌模型 ,观察气管内应用AdIL 12对实验性肺转移癌的治疗作用 ,包括肺转移结节、动物存活期、生存率变化等 ,比较自然杀伤活性(NK )和特异性细胞毒 (CTL )活性的差异。结果显示 :(1)气管应用AdIL 12后肺灌洗液中测到IL 12 ,且浓度高于外周血水平 (P <0 0 1) ,对照组肺灌洗液及外周血中均未检出 ;(2 )气道应用AdIL 12对实验性肺转移癌有治疗作用 ,可使肺转移结节减少、动物的生存期延长及存活率升高 ,并增强了NK、CTL活性。本研究表明气道内应用AdIL 12对实验性肺转移癌有治疗作用。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/VP1的构建及免疫效果研究

 目的 构建柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)VP1基因重组腺病毒疫苗Ad/VP1,并观察其对小鼠的免疫效果。方法 利用AdEasy-1系统构建、包装重组腺病毒Ad/VP1,并检测目的蛋白的表达。BALB/c小鼠随机分为Ad/VP1、Ad和PBS 3组,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次间隔16d。用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清CVB3 VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率。结果 成功构建、包装了重组腺病毒Ad/VP1,并在293细胞中检测到VP1蛋白的表达。免疫小鼠后,Ad/VP1组血清CVB3 VP1 IgG滴度、中和抗体水平明显高于PBS和Ad对照组(P<0.01),CTL杀伤活性和对小鼠的保护率也高于对照组(P<0.05),血清病毒滴度低于两对照组(P<0.05)。结论 重组腺病毒疫苗Ad/VP1能显著提高小鼠的细胞和体液免疫应答及免疫保护作用。