重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

人sCR1转化克隆菌的快速筛选和鉴定

目的 用G418快速筛选及鉴定重组人可溶性补体受体1型（sCR1）高拷贝转化克隆菌。方法 采用的sCR1重组质粒，经电转化将其克隆入SMD1168细胞中，利用G418的抗性，快速筛选转化克隆菌，并对克隆菌株提取基因组DNA进行聚合酶链反应（PCR）鉴定；该克隆菌经甲醇诱导培养后，对其表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot鉴定分析。结果 从G418快速筛选的酵母克隆菌株中提取的基因组DNA进行PCR鉴定，获得了高拷贝整合的重组酵母克隆菌株，经诱导培养后，对其表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定分析，该表达蛋白在SDS-PAGE上表现为相对分子质量大于30 000的蛋白区带，在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别，成功获得高拷贝整合的重组酵母细胞株，可表达出重组人sCR1融合蛋白。结论 经高浓度G418药物快速筛选的高拷贝SMD1168细胞株，用于表达人sCR1融合蛋白。     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究

目的得到一株产人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase-2,ALDH2)的重组毕赤酵母菌株,优化其发酵条件以满足生产和科研需求。方法将ALDH2基因整合到质粒pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-ALDH2,将重组表达质粒pPIC9K-ALDH2经电转化到毕赤酵母SMD1168中,转化子经MD平板筛选后,用G418筛选多拷贝重组子,测序鉴定。通过改变诱导温度、pH、初始OD值、甲醇浓度等诱导条件,对SMD1168(pPIC9K-ALDH2)发酵的条件进行优化。结果ALDH2cDNA整合到毕赤酵母基因组中,得到SMD1168(pPIC9K-ALDH2);获得最佳的诱导表达优化条件:在28℃、pH=7.0、诱导初始OD600=12、每隔24h添加1.5%甲醇、转速为300r/min,发酵所产生的人ALDH2酶活可达到0.115U/ml,相对较高。结论以蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1168为宿主,分泌表达质粒pPIC9K为载体,能够成功构建重组子SMD1168(pPIC9K-ALDH2)。     

重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的:采用酵母多拷贝分泌表达载体pPIC9K表达重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体cRFB4FC和cRFB4CH3,并进行活性检测。方法:采用基因克隆技术获得两抗体的基因,然后将其克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母SMD1163中,将经G418抗性筛选出的重组酵母菌株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,经ELISA检测生物学活性。采用正交试验优化重组酵母菌株的表达条件以提高抗体的表达量。结果:获得重组表达质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,经甲醇诱导表达出cRFB4FC和cRFB4CH3蛋白。它们在SDS-PAGE上分别表现为相对分子质量(Mr)约326 000和295 000的蛋白区带,在Western blot分析中均可被山羊抗人IgG Fc单克隆抗体(mAb)识别,经ELISA分析它们都具有较高的生物学活性。优化表达条件后,抗体的表达量分别提高了196.4%和151.7%。结论:抗体cRFB4FC和cRFB4CH3在酵母菌SMD1163中成功获得高效分泌表达,并有免疫学活性。     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

人补体受体1型SCR1-3功能域基因的克隆表达及生物活性鉴定

目的实现人补体受体1型功能域SCR1-3基因的克隆、表达及生物学活性鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,通过逆转录获得cDNA,PCR扩增获得编码CR1-SCR1-3基因序列;克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,菌落PCR、双酶切鉴定后测序;线性化重组质粒电转化毕赤酵母KM71基因组中,经菌落PCR技术筛选在G418平板上生长的多拷贝阳性转化子;摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白表达;镍柱亲和层析纯化目的蛋白;用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果获得了人CR1-SCR1-3编码区序列,测序结果与与GenBank中的相应序列一致;SDS-PAGE和Western-blot表明目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;体外实验证实经纯化后的CR1-SCR1-3能够明显抑制补体溶血。结论成功构建重组表达质粒pPIC9K-CR1-SCR1-3,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR1-3的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体生物活性。     

食管癌相关基因1在甲醇酵母中的表达与纯化

目的为获得食管癌相关基因1(ECRG1)编码的活性蛋白,利用甲醇酵母系统表达ECRG1。方法将本研究室构建的PCDNA6-HA-ECRG1重组到分泌表达载体pPIC9k中,然后转入酵母GS115,通过G418筛选,在甲醇的诱导下,获得表达的蛋白。结果成功构建了分泌表达重组体pPIC9k-ECRG1,并转入了GS115,筛到抗2.5mg/ml G418的重组菌株,在甲醇的诱导下,ECRG1蛋白得到了分泌表达,发酵培养获得的融合蛋白经镍离子亲和层析,得到纯度80%左右的蛋白。结论用酵母表达系统得到了活性蛋白,可用于进一步的生物功能及作用机理的研究,也为今后研究基因-蛋白的功能与结构,提供了分离和纯化蛋白的重要方法。     

人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2)gag蛋白基因在毕赤酵母中的克隆表达

目的：实现HIV-2HCOgag重组蛋白的分泌表达，为研究HIV—2HCO gag蛋白结构与功能及亚单位蛋白疫苗研究打下基础。方法：将HIV-2HCOgag蛋白基因片段，与分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9重组，构建了相应的重组表达质粒pPIC9-gag，转化GS115酵母菌，经MD／MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆，以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Wgtem blot证实。结果：获得了HIV—2HCOgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的分泌表达，表达产物可被HIV—2抗血清识别，分子量约为57kD。结论：pPIC9—gag重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HIV—2HCOgag蛋白，该蛋白具有强免疫学活性。     

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR), 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性.方法:利用RT-PCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18-T载体, 进行双链核苷酸序列测定.构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA- TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析, 采用Co2 离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性.结果:克隆了TYR基因.构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR.SDS-PAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应.结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性.     

ＶＥＧＦ１６５cＤＮＡ在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的 研究人ＶＥＧＦ１６５基因在Ｐichia pastoris酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组hVEGF165。方法 采用ＰＣＲ扩增hVEGF165基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１α分泌信号肽序列的Ｐichia pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/hVEGF165。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用１０mL/L甲醇诱导表达。表达产物经Ｈeparin-SepharoseCL6B亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４d的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。Ｗestern blot表明。表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈep-arin-SepharoseCL6B亲和层析纯化,rhVEGF165的纯度可达到９０％以上,生物学活性检测证实。结论 在Pichia pastoris表达系统中,实现了hVEGF165的高效分泌性表达。     

结核分枝杆菌脂蛋白G在HEK293T细胞中的表达及纯化

目的构建含结核分枝杆菌(MTB)脂蛋白G(Lpr G)基因的真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,并在HEK293T细胞中表达和纯化Lpr G融合蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用PCR法扩增Lpr G基因,并通过DNA重组构建真核表达载体pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG,酶切鉴定并测序。将重组质粒转染HEK293T细胞后,应用Western blot法检测His-Lpr G-FLAG融合蛋白的表达。利用Ni-NTA金属亲和层析柱从细胞上清和细胞裂解液中纯化融合蛋白His-Lpr G-FLAG,并用SDS-PAGE和Western blot法检测纯化后的蛋白。结果成功构建了pc DNA3.1-His-Lpr G-FLAG的真核表达载体,Western blot结果表明转染质粒后,HEK293T细胞裂解液中检测到目的蛋白,相对分子量(Mr)为27 000。经Ni-NTA金属亲和层析柱纯化后得到高纯度的融合蛋白His-Lpr G-FLAG。结论成功构建并在HEK293T细胞中表达和纯化了His-Lpr G-FLAG融合蛋白。     

FSH-occludin融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及免疫原性检测

目的 纯化FSH-occludin融合蛋白,并检测其免疫原性.方法 将表达FSH-occludin 蛋白的酵母工程菌GS115/ pPIC9K接种到YPD培养基中多次传代后,用PCR 检测其目的 基因.该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析,并将纯化蛋白免疫Balb/c 小鼠,检测其血清抗体水平 ,以免疫组化的方法分析各组织occludin的表达与定位.结果 该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失,Western blot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性,免疫组化证实occludin在实验组高表达.结论 表达FSH-occludin蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性,其表达产物可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答.     

乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白。方法：将JEV E蛋白基因亚克隆人真核表达载体pPIC9K，以电穿孔法转化酵母SMD1168。用MD平板筛选重组子、G418筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果：由于糖基化不同，所表达产物的相对分子质量(Mr)约为113000和78000，表达量约为50mg/L。结论：在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白，为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。     

人肝细胞癌相关抗原661基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

目的构建人肝细胞癌相关抗原661(Hepatocellular carcinoma-associated antigens 661,HCA661)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白.方法人肝细胞癌SMMC7721细胞基因组DNA经PCR扩增HCA661基因,克隆到pGEM-T easy中进行酶切、PCR和测序鉴定;构建重组质粒pQE-HCA661,并转化大肠杆菌M15[pREP4],经IPTG诱导表达目的蛋白;镍离子亲和层析柱(Ni2 -NTA)纯化靶蛋白后进行Western blot鉴定.结果目的基因经酶切和PCR鉴定结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GeneBank登录的序列完全一致;工程化大肠杆菌M15[pREP4]经IPTG诱导表达约39 kD的目的蛋白.Western blot鉴定结果显示,纯化重组蛋白能够分别与抗His单克隆抗体和抗HCA661多克隆抗体特异性结合.结论本实验成功地构建了重组原核表达质粒pQE-HCA661,工程菌表达的重组HCA661带有6×His标签,并具有免疫原性,可以用于制备单克隆抗体,或用于检测患者血清中肝细胞癌抗体以预测肿瘤恶性程度.     

用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白

目的 利用甲醇酵母系统Pichia pastoris高效表达HPV6型L1蛋白。方法 按照Pichia pastoris偏爱密码子合成L1全长基因，构建pPIC3．5K-HPV6-L1表达载体，转化KM71，经组氨酸缺陷的MD培养基和G418筛选，PCR确认L1基因整合，使用BMGY／BMMY培养，诱导目的基因的表达。结果 筛选到3株阳性表达克隆，Western blot显示表达产物有部分糖基化现象，使用能识别完整VLP的单抗进行间接免疫荧光检测提示L1蛋白在Pichia细胞内以空间构象形式存在。通过离子交换和亲和层析两步纯化从1L发酵液中得到125μg纯的Ll蛋白。结论 通过基因优化在甲醇酵母中表达HPV6-L1蛋白，这将为结构与功能研究以及疫苗开发提供条件。     

肠道病毒71型VP1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。结果 SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致。Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/m L,纯化度达90%。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

AChRα211的分泌表达及其对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用

目的在毕赤酵母(P．pastoris)中分泌表达AChRα211，研究其对重症肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。方法以质粒pUC—AChRα211为模板，PCR扩增人AChRα21 DNA片段，插入真核表达载体pPIC9K中。重组质粒转入P．paatoris GS115后，经甲醇诱导分泌表达AChRα211，用Sepharose Q离子交换柱和Superdex 75分子排阻层析进行纯化。Western blot和ELISA进行免疫活性分析后，将目的蛋白偶联于CNBr-Sepharose 4B树脂上，研究该免疫吸附剂对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。结果双酶切鉴定和序列分析表明，AchRα21 DNA片段已正确插入到pPIC9K载体中。重组菌P．pastoris GS115／pPIC9K—AChRα211经甲醇诱导可分泌表达目的蛋白AChRα211，经阴离子交换柱和分子排阻层析可得95％纯AChRα211。并制备成免疫吸附剂。Western blot和ELISA分析表明，重组蛋白具有与天然AChRα亚基相似的免疫活性。免疫吸附实验表明该重组蛋白可特异性地去除肌无力患者血清中的AChRAb。结论在P．pastoris中分泌表达并纯化重组蛋白AChRα211，制备成一种新的免疫吸附剂AChRα211-Sepharose，可清除肌无力患者血清中的AChRAb。     

Myc-R9-EGFP融合蛋白的表达及穿膜能力鉴定

构建、表达、纯化和鉴定Myc-R9-EGFP融合蛋白,验证其在体外培养成纤维细胞中的转导活性。从胎猪原始生殖嵴中提取总RNA,反转录cDNA第一链。设计带九聚精氨酸(R9)的特定引物,从cDNA中扩增出猪c-Myc基因,克隆到pET-28a-EGFP载体中,经酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,Ni 2+柱亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达产物后,将Myc-R9-EGFP蛋白作用于体外培养的猪胎儿成纤维细胞以观察其转导活性。结果显示:Myc-R9-EGFP融合蛋白原核表达载体构建正确,目的蛋白在诱导后获得了高效表达,经SDS-PAGE和Western blot检测证实融合蛋白片段大小正确,并在体外培养的成纤维细胞中证实了其高转导活性。本实验为进一步研究Myc蛋白的生物学特性和利用重组蛋白建立诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的研究奠定了基础。     

VLDL-R配体结合结构域的克隆与表达

目的构建含VLDL-R配体结合结构域融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达与纯化。方法利用PCR技术扩增LBR1-8的DNA片段,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,随后将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌Rosetta中,利用IPTG诱导蛋白表达并优化其表达条件,表达产物经Ni -NTA亲和层析柱纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR,酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主经过IPTG诱导成功表达了LBR1-8,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建pET28a( )-LBR1-8表达质粒,表达并经纯化得到了LBR1-8。