EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响

背景与目的:已证实EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein,LMP1)具有转化致瘤作用,在鼻咽癌的发生发展中起重要作用。LMP1的转化致瘤作用可能与细胞凋亡有关,本实验目的是观察EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响,探索LMP1在鼻咽癌发生发展中的可能机制。方法:用电转染的方法将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,用荧光显微镜检测报道基因GFP的表达情况;用免疫组化法及Westernblot法检测目的基因LMP1的表达情况;用流式细胞仪、荧光染色及DNA片段分析等方法检测在有地塞米松磷酸钠或无血清饥饿诱导的情况下LMP1对CNE1细胞凋亡的影响。结果:CNE1G细胞(转染空载质粒PAT-GFP的CNE1细胞)及CNE1GL(转染目的基因质粒PAT-GFP-LMP1的CNE1细胞)有绿色荧光蛋白表达,CNE1细胞(未经转染的CNE1细胞)无绿色荧光蛋白表达;CNE1GL细胞LMP1呈阳性表达,而CNE1及CNE1G细胞均为阴性。CNE1、CNE1G及CNE1GL3组细胞分别用地塞米松磷酸钠或无血清1640培养液处理后均有凋亡出现,且两种诱导方法均能使CNE1GL组细胞的凋亡指数(apoptosisindex,AI)较CNE1及CNE1G组明显增高(P<0.05),而CNE1与CNE1G组的凋亡指数无明显差别。3组细胞常规培养下则无凋亡出现。结论:LMP1基因成功导入CNE1细胞     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）对人高分化鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响。方法采用电穿孔基因转染技术。将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,以载体质粒转染及CNE1细胞为对照组,用免疫组化检测LMP1蛋白的表达;用细胞体外增殖实验检测细胞OD比值;用裸小鼠成瘤实验观察移植瘤体积倍增时间和生长率。结果内动物实验细胞移植后CNE1GL组潜伏期缩短,第7、8、9周时,其平均肿瘤体积生长显著高于对照组（P〈0.05）;体外细胞增殖实验3组细胞OD比值差异无显著性（P〉0.05）。结论EBV-LMP1对CNE1细胞的体内增殖能力可能有促进作用。     

携带绿色荧光报告基因EBV-LMP2A真核表达载体构建及转染鼻咽癌细胞

目的 构建携带绿色荧光基因的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A,并转染至鼻咽癌CNE2细胞。方法 从EB病毒阳性的狨猴淋巴瘤细胞B95-8中克隆EB病毒编码的ＥＢＶ潜伏膜蛋白2A（latent membrane protein 2A,LMP2A）序列,并定向克隆入pIRES2-Zs-Green1载体,双酶切及测序鉴定重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A;通过脂质体转染将重组的真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A转染至鼻咽癌CNE2细胞（实验组）,同时另设转染pIRES2-Zs-Green1载体的阴性对照组及未转染的空白对照组。利用质粒所携带的绿色荧光蛋白表达计算细胞转染效率,RT-PCR检测目的基因LMP2A在鼻咽癌CNE2细胞中的表达。结果 双酶切及测序鉴定证实真核表达载体pIRES2-Zs-Green1-LMP2A构建成功,荧光显微镜下发现实验组和阴性对照组细胞均发出绿色荧光,实验组细胞转染率约为75%;RT-PCR检测发现实验组细胞中有目的基因LMP2A表达,但阴性对照组和空白对照组均未检测到目的基因表达。结论 成功构建了pIRES2-Zs-Green1- LMP2A真核表达载体并转染鼻咽癌CNE2细胞,目的基因LMP2A可在转染的鼻咽癌CNE2细胞中稳定表达。     

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP 1的表达

目的：探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况。方法：用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况。结果：免疫组化及Western bolt法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达。结论：人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关。     

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP1的表达

目的:探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况.方法:用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况.结果:免疫组化及Western bolt 法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达.结论:人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关.     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响

背景与目的:已证实EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)能够诱导鼻咽癌细胞中基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)的表达。本实验的目的是观察EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响,探讨LMP1在鼻咽癌侵袭、转移过程中的作用。方法:用免疫组化法及Westernblot法检测CNE1-GL(转染LMP1基因的CNE1细胞)和CNE1细胞中MMP-9的表达情况;用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测LMP1对CNE1细胞粘附、运动及侵袭能力的影响。结果:免疫组化法及Westernblot法结果均显示CNE1-GL细胞中MMP-9的表达明显高于CNE1细胞(P<0.05);肿瘤细胞-基质粘附实验结果显示,CNE1-GL的粘附能力(平均吸光度值为1.2508±0.0711),高于CNE1细胞(平均吸光度值为0.9519±0.068),两者相比差异有显著性(P<0.01)。运动实验及重组基底膜侵袭实验结果均显示,穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(polyvinylpyrroli-done-free,PVP-F)的CNE1-GL细胞数明显高于CNE1细胞(P<0.01)。结论:LMP1能够诱导CNE1细胞中MMP-9的表达,且增强CNE1细胞与基底膜的粘附能力、运动能力及侵袭能力。     

ALDH1A1基因表达沉默对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨干扰乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）基因表达后对鼻咽癌5-8F和CNE2细胞生长、增殖的影响。方法：构建ALDH1A1 siRNA 表达质粒稳定转染鼻咽癌5-8F和CNE2细胞,Western blot 检测干扰ALDH1A1基因蛋白表达水平。MTT、平板克隆、裸鼠成瘤实验检测干扰ALDH1A1基因前后鼻咽癌5-8F和CNE2细胞的增殖、克隆及成瘤能力。结果：与空白组和阴性对照组相比,干扰ALDH1A1表达后5-8F和CNE2细胞增殖、克隆及肿瘤形成能力明显受到抑制。结论：干扰ALDH1A1基因表达,可抑制鼻咽癌细胞的生长、增殖、克隆及成瘤能力。     

NF-кB介导LMP1在鼻咽癌干细胞SP18增殖中的作用

目的探讨LMP1-CTAR2影响鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用机制。方法采用逆病毒感染方式,建立稳定表达LMP1及CTAR2的TRADD活性区突变型LMP1(LMP1TRADD)的鼻咽癌干细胞SP18细胞系(空载体pLNSX为阴性对照),通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验、平皿克隆形成实验和流式细胞术观察LMP1TRADD对鼻咽癌干细胞SP18增殖的影响。同时利用Western-blot检测细胞中NF-кB P65蛋白的表达。结果 (1)SP18-LMP1细胞生长较SP-pLNSX细胞加速,增殖指数增加(n=3,P<0.01)。(2)SP18-LMP1TRADD细胞的生长速度较SP18-LMP1细胞减慢,增殖指数降低(n=3,P<0.01)。(3)SP18-LMP1TRADD细胞中NF-кB P65蛋白的表达水平较SP18-LMP1细胞降低,与SP-pLNSX细胞相似。结论 NF-кB通过介导LMP1-CTAR2胞内信号,降低SP18细胞的增殖指数,影响细胞的增殖。     

两种不同来源 LMP1致瘤性的比较研究

目的：比较鼻咽癌来源的LMP1基因（N-LMP1）和标准株B95.8来源的LMP1基因（B-LMP1）的致瘤性。方法：将带有N-LMP1及B-LMP1的两种真核表达载体分别转染小鼠成纤维细胞系NIH3T3，获得稳定表达LMP1的细胞，通过软琼脂集落形成试验及裸鼠致瘤试验比较两种细胞的致瘤性。结果：获得稳定表达N-LMP1和B-LMP1的两种NIH3T3细胞；NIH3T3/N-LMP1的集落形成率和成瘤率均明显高于NIH3T3/B-LMP1。结论：N-LMP1的致瘤性强于B-LMP1，进一步确证了中国鼻咽癌来源的EBVLMP1比一般的EBV LMP1具有更强的致瘤性，也为在中国鼻咽癌流行区可能存在一株特殊的EBV株系提供了一定的依据。     

NP9基因抑制鼻咽癌细胞成瘤的实验研究

目的确定NP9基因的表达对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响,并探讨其机制。方法构建NP9基因的真核表达载体,转染重组pR c/CMV2-NP9质粒于鼻咽癌细胞系CNE1和SUNE1,筛选并获得稳定表达NP9基因的细胞克隆CEN1/NP9和SUNE1/NP9。以裸鼠致瘤实验确定NP9基因对鼻咽癌细胞成瘤特性的影响;通过免疫组化检测移植瘤中增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyc lin D1)的表达。结果大部分转基因的G418抗性克隆能够检测到NP9基因的表达。CNE1/NP9细胞接种裸鼠后的成瘤率为43.8%,明显低于CNE1细胞(66.7%)和CNE1/空载体组(75.0%,P均<0.05)。SUNE1/NP9细胞接种裸鼠后移植瘤的生长速度减慢,第30天时肿瘤体积为(3.88±0.81)cm3,与SUNE1细胞和SUNE1/空载体组差异均有统计学意义(P均<0.05)。CNE1/NP9细胞的移植瘤显示出相对较低的PCNA和cyc lin D1表达水平。结论NP9基因通过下调PCNA和cyc linD1的表达,抑制鼻咽癌细胞的裸鼠成瘤或移植瘤的生长。     

定量研究EB病毒潜在膜蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE1的作用

目的研究ＥＢ病毒ＬＭＰ对人高分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１细胞形态及ＤＮＡ含量的影响。方法采用电穿孔基因转染技术，将重组ＥＢＶ┐ＬＭＰ表达质粒转染鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１细胞。以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照，用免疫荧光和图像分析方法，观察细胞ＬＭＰ表达、细胞形态及ＤＮＡ含量的变化。结果ＬＭＰ表达质粒转染后细胞浆及细胞膜ＬＭＰ强阳性表达。形态定量及ＤＮＡ含量测定表明，ＬＭＰ表达后，ＣＮＥ１细胞明显变小（Ｐ＜０．０１），核浆比显著增大（Ｐ＜０．０１），核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系；ＤＮＡ含量明显增高（Ｐ＜０．０１／０．０５），且倍体分布更分散而右移。结论ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用，可致细胞恶性程度增高且分化受抑，有向低分化鳞癌发展倾向，提示ＬＭＰ在ＮＰＣ的发生发展过程及其演进中可能起重要作用     

潜伏膜蛋白1 对鼻咽癌细胞CNE1 中端粒酶的 激活作用及相关调控机制

 目的　探讨LMP1 对鼻咽癌上皮样细胞系CNE1 (nasopharyngeal carcinoma epithelioid cell lines , CNE ) 中端粒酶活性的影响及相关调控机制。方法　分别采用SP 法、RT2PCR 法和PCR2ELISA 法检测鼻 咽癌细胞CNE1 、CNE1GL (转染了目的基因质粒PAT2GFP2LMP1 的CNE1 细胞株) 和CNE22Z 中LMP1 、 NF2κB、c2myc 和hTERT 的表达、hTERT mRNA 水平和端粒酶活性。结果　(1) CNE1GL 与CNE1 细胞相 比,LMP1 、NF2κB、c2myc、hTERT 的表达水平均高于CNE1 细胞中各指标的表达,差异有统计学意义( P < 0. 01) 。CNE22Z和CNE1GL 、CNE1 相比,细胞中各指标的表达水平均最高( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。 CNE1GL 细胞中,LMP1 与NF2κB、NF2κB 与c2myc 及LMP1 与c2myc 的表达之间均呈显著正相关( P < 0. 01或P < 0. 05) 。(2) hTERT mRNA 水平在CNE1GL 细胞明显高于CNE1 细胞,差异有统计学意义( P < 0. 01) ;在三种细胞中,CNE22Z细胞中hTERT mRNA 水平最高( P < 0. 01) 。(3) CNE1GL 细胞中的端粒酶 活性明显高于CNE1 细胞,差异有统计学意义( P < 0. 05) ;CNE1GL 细胞中的端粒酶活性略低于CNE22Z 细胞( P > 0. 05) ;CNE22Z细胞中的端粒酶活性明显高于CNE1 细胞( P < 0. 01) 。结论　在CNE1GL 细胞 中,LMP1 通过激活hTERT 转录而激活端粒酶。此调控过程可能和NF2κB 激活,NF2κB 进而上调c2myc 表达水平,c2myc 提高hTERT 转录水平有关。LMP1 激活端粒酶可能是鼻咽癌癌变过程中的重要事件。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞系CNE1有丝分裂调控机制的影响

EB病毒潜伏膜蛋白(latent membrane protein l,LMPl)是被证实在鼻咽癌中具有癌基因功能的病毒编码基因的表达产物;LMPl参与异常的细胞周期调控,但是否导致有丝分裂检测点调控机制紊乱仍未得到实验证实。本实验观察LMPl对鼻咽癌细胞株CNEl有丝分裂调控的影响,进一步探讨LMPl在鼻咽癌发病机制中的作用。     

EB病毒潜伏膜蛋白抑制鼻咽癌细胞分化的定量分析

为了探讨ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＥＢＶ－ＬＭＰ）对鼻咽癌（ＮＰＣ）细胞体外分化及分化诱导剂二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）敏感性的影响。以ＥＢＶ－ＬＭＰ基因转染人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）,并用ＤＭＳＯ诱导,采用免疫组化及图像分析法观察细胞分化及形态的变化。结果显示：ＤＭＳＯ体外诱导ＣＮＥ１细胞生长明显受到抑制,细胞变大,核浆比值明显变小（Ｐ＜０．０１）,细胞角蛋白表达显著增高（Ｐ＜０．０１）;ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞的生长,细胞变小,核浆比值明显变大（Ｐ＜０．０１）,细胞角蛋白表达显著下降（Ｐ＜０．０５）,有向低分化鳞癌发展倾向;ＬＭＰ基因转染细胞诱导后体外生长和角蛋白表达无显著改变（Ｐ＞０．０５）。结果表明,ＤＭＳＯ可在一定程度上诱导ＣＮＥ１细胞分化;ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用,可抑制细胞分化;ＬＭＰ可降低ＣＮＥ１细胞对终末分化信号的反应,这有助于对ＮＰＣ发生机理的深入研究及防治     

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。     

EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响

背景与目的:EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌的浸润和转移过程中起重要的作用。本实验目的在于研究EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响和探讨其中的相关机制。方法:应用免疫细胞化学RT-PCR法和Western blot检测LMP1、E-cadherin和intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)在人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和转染了LMP1基因的CNE1-GL细胞中的表达。应用细胞-细胞粘附实验、细胞-基质粘附实验、划痕实验和细胞运动实验观察LMP1对鼻咽癌细胞粘附和运动能力的影响。结果:免疫细胞化学结果显示:LMP1在CNE1和CNE1-GL细胞中的阳性率分别为0和(96.60±3.03)%(P<0.01);E-cadherin蛋白的阳性率分别为(37.47±1.50)%和(19.53±1.92)%(P<0.01);ICAM-1蛋白的阳性率分别为(5.27±1.45)%和(93.33±4.23)%(P<0.01)。RT-PCR和Westernblot结果表明,与CNE1细胞相比较,CNE1-GL细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),而ICAM-1的mRNA和蛋白表达则明显升高(P<0.01)。肿瘤细胞同质粘附实验显示,CNE1-GL细胞的同质粘附能力较CNE1细胞弱(P<0.05)。肿瘤细胞-基质粘附实验得出CNE1-GL细胞的异质粘附能力(A值=0.60±0.03)较CNE1细胞(A值=0.46±0.01)强(P<0.01)。肿瘤细胞运动实验显示,穿过PVPF膜的CNE1-GL细胞数多于CNE1细胞(119.3±6.0 vs 46.3±7.0,P<0.05)。结论:LMP1通过抑制E-cadherin表达、促进ICAM-1表达从而抑制肿瘤细胞的同质粘附能力、增强其异质粘附能力和运动能力来参与鼻咽癌的侵袭和转移。