Effect of overexpressed Golgi α-mannosidase Ⅱ on proliferation in human gastric cancer cell line BGC-823

目的 探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响.方法 构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率.用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2 mRNA的表达,用Westem blot 法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响.结果 GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加.转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),但对bcl-2的调节作用不明显.结论 过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关.     

过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响

目的探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响。方法构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率。用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2 mRNA的表达,用Western blot法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响。结果 GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加。转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对bcl-2的调节作用不明显。结论过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关。     

汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白基因表达载体的构建及表达

摘要：目的构建汉坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达载体并将其在Vero E6细胞中进行表达,观察细胞融合现象。方法采用PCR和基因克隆技术,将GM04 38株G1、G2基因分别克隆到表达载体pCAGGS／MCS,酶切和测序鉴定正确后,将表达载体pCAGGS-G1、pCAGGS-G2共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理后观察细胞融合现象的产生,并以间接免疫荧光试验(IFA)观察糖蛋白的表达情况。结果显示在Vero E6细胞中成功表达出糖蛋白G1、G2,IFA显示荧光信号分布在细胞浆中。二者的共表达可产生良好的生物学活性,在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞没有融合现象发生。共表达也未出现明显的促进效应。结论成功构建了糖蛋白G1、G2的表达载体,并在Vero E6细胞中呈有效表达,二者的共表达可在偏酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。     

TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

目的 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法 将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用.结果 经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C.ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用.结论 成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应.     

小鼠肠道抗霍乱毒素浆细胞的诱生及其检测

报道一种诱导及检测小鼠肠道抗霍乱毒素免疫反应的方法。小鼠经粗制霍乱毒素(CrT)口服免疫3次后,用免疫荧光法染色小鼠肠组织切片,发现固有层中有大量抗霍乱毒素浆细胞(ACC)存在。免疫反应的高峰为末次免疫后第6天,此时,经肠段结扎试验证实,小鼠获得完全保护力。统计学结果表明,免疫小鼠空肠固有层中ACC量与保护性免疫力间呈高度显著的相关性(r=0.88,P<0.01)。本研究提示,用免疫荧光法计数肠固有层中的ACC,能从细胞水平上较准确、客观地测知肠道局部免疫力。     

外源性p16基因稳定转染对喉癌细胞周期和增殖的影响

目的：探索p16基因在喉癌细胞内的表达作用及基因治疗方面的应用前景。方法：采用亚克隆技术，构建p16真核表达载体pCDNA3-p16.利用lipofectamine介导，将外源野生型p16基因导入喉癌细胞系Hep-2，筛选阳性克隆，采用打点杂交技术、免疫荧光、免疫组化、图像分析法观察和分析p16基因的表达。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，用流式细胞仪分析瘤细胞生长周期、荧光染色检测细胞凋亡。结果：打点杂交、免疫荧光、免疫组化及图像分析法分析证实转染p16基因的Ｈep-2细胞有外源p16基因的表达，外源基因p16在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。流式细胞仪计数和免疫荧光检测证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论：导入外源野生型p16基因可抑制喉癌细胞恶性增殖。     

构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗

目的　构建免疫球蛋白重链可变区 (IgHV)基因片段与细胞因子粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)或白细胞介素 2 (IL 2 )的融合基因表达载体作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗 ,接种动物了解该疫苗抗淋巴瘤免疫功能。方法　从脐带血免疫球蛋白基因文库获得 6个片段长度差异较大的IgHV3基因片段 ,测序后利用生物信息资源分析预测其重链可变区的T细胞表位 ,分析IgHV1 6个片段。选择包含了绝大多数T细胞表位的IgHV1、IgHV3基因 ,将框架区 (FR)为主的IgHV(FR)基因片段及IgHV(FR)与GM CSF或IL 2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体中。表达载体通过脂质体转染COS细胞 ,ELISA法确定GM CSF或IL 2的表达情况。将一些表达载体作为核酸疫苗免疫小鼠 ,通过间接免疫荧光法和细胞因子分泌法检测小鼠抗同一家族淋巴瘤和正常淋巴细胞的免疫反应。结果　计算机评分系统预测显示在每个IgHV序列中约存在 30个左右分别受HLA位点限制的T细胞表位 ,90 %以上的T细胞表位位于框架区 ,积分排位于前 1 0 %的T细胞表位都位于框架区。构建了去除CDR3区后以框架区 (FR)为主的IgHV1 (FR)和IgHV3(FR)真核表达载体。将GM CSF或IL 2基因连接到 2个IgHV基因的 3′端。IgHV (FR ) GM CSF/pcDNA3.0中GM CSF的表达量高于对照组 2 0     

肾癌G250抗原基因在sp2/0细胞中的表达及其意义

 【目的】将G250抗原cDNA片段转染入sp2/0细胞中并获得稳定表达,为G250基因疫苗研究提供实验工具。【方法】用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入sp2/0细胞中,经G418筛选得到稳定表达,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光、Western blot检测G250基因在sp2/0细胞中的表达。【结果】转染2周后,筛选出阳性sp2/0细胞克隆,通过RT-PCR证实有G250mRNA转录,间接免疫荧光可以见到阳性细胞,Western blot证实有G250抗原表达。【结论】建立了稳定表达G250抗原的肿瘤细胞模型,为研究基于肾癌G250基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。     

霍乱、副霍乱病原学诊断及有关免疫学的研究

一、关于霍乱及副霍乱病原学诊断研究1.霍乱肠毒素影响因素研究证实肠毒素的产生与菌株生长对数期相关,6小时开始产毒,36小时达高峰;霍乱569B株较副霍乱23 62株产毒高40-80倍;将培养温度由37℃改为30℃可提高产毒能力16-25倍;L-组氨酸可提高产毒2.5-10倍。Mg~(++)、Fe~(+++)微量金属元素对产毒有促进作用。从而摸索到人工产肠毒素的适宜条件。2.霍乱肠毒素检测方法研究建立了豚鼠及家兔皮内法、肠段结扎法、口饲感染法测定肠毒素,还在国内首先建立y-1、CHO细胞测毒素法。对569B毒素,y-1细胞较家兔法高4-12.9倍;对23 62毒素、     

HBsAg和GM-CSF融合表达质粒的构建

目的：构建乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒，借助GM—CSF的免疫佐剂作用，提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法：用PCR方法分别从pEcob6和pCD-hGM—CSF中扩增出基因S和GM-CSF，克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )中，构建pcDNA3．1-S及融合表达质粒pcDNA3．1-GM-CSF-S，然后以重组质粒转染真核细胞，研究重组质粒体外表达。结果：经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确，细胞转染试验表明重组质粒能在COS-7及HepG-2内表达。结论：乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒构建成功，重组质粒能在真核细胞内表达。     

IFN-α及其联合GMCSF对CML患者骨髓细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 :探讨IFN α及IFN α联合GM CSF调节慢性期慢性粒细胞白血病 (CML CP)患者骨髓单个核细胞(MNCs) bcr abl,bcl 2 和 c myc基因表达的影响。方法 :淋巴细胞分离液离心富集 14例CML CP患者骨髓MNCs,经干扰素 α(IFN α)及IFN α联合粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)培养 2 4h后 ,采用相对定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)及扩增片段光密度扫描分析bcr abl,bcl 2 ,c myc及β actin 基因表达水平 ,配对t检验统计分析组间差异。结果 :IFN α(2 0 0U·ml-1)及IFN α(2 0 0U·ml-1)联合GM CSF(10ng·ml-1)均显著抑制bcr abl基因表达 ;IFN α部分抑制 c myc及 bcl 2 基因表达 ;GM CSF在IFN α作用的基础上部分促进 bcr abl及 c myc基因表达和显著抑制 bcl 2 基因表达。结论 :IFN α及IFN α联合GM CSF均可抑制抗凋亡基因bcr abl和bcl 2基因表达 ,并调节c myc基因表达水平。通过促进细胞凋亡而抑制恶性克隆增长是IFN α或IFN α联合GM CSF治疗CML的可能作用机制。     

rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的:构建ltB/ctB-ompL1/1融合基因及其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性,检测问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株ompL1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平.方法:采用连接引物PCR构建ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE、Western blot和GM1-ELISA分别检测目的重组蛋白rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达量、免疫反应性及与GM1结合的活性.采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株ompL1基因及其表达情况.采用ELISA检测228例钩体患者血清ompL1基因产物的抗体.结果:与报道的相关序列比较,ltB-ompL1/1和ctB-ompL1/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性,分别为99.7%～99.9%和99.5%～100%.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1均分别能与rOmpL1/1兔抗血清和牛GM1结合.89.7%问号钩体野生株含有ompL1基因,87.6%问号钩体野生株分别与rOmpL1/1和rOmpL1/2兔抗血清出现效价,为1:4～1:256的MAT阳性结果.86.8%和88.6%的患者血清标本rOmpL1/1和rOmpL1/2抗体阳性.结论:rLTB-rOmpL1/1和rCTB-rOmpL1/1融合蛋白有良好的免疫原性及与GM1结合的活性.不同问号钩体血清群中广泛存在ompL1基因并高频率表达,不同基因型表达产物有广泛的交叉抗原性.     

The Effects of Wild-type p5 3Gene Transfection on the Growth and Chemotherapeutic Sensitivity of Human Glioma Cells

In gliomas,p5 3 mutations are among the mostfrequently observed genetic findings[1] .As a tu-mor- suppressor gene,p5 3 mutations can lead touncontrolled cell proliferation[2 ] . It was reportedthat loss of wild- type p5 3 function decreased sensi-tivity of tumor cells to chemotherapy[3 ] . In thisstudy,wild- type p5 3 gene was delivered into hu-man glioma cell line U2 5 1 by using liposome- medi-ated transfection technique to observe the effects ofp5 3 gene treatment and combined treatment of …     

MP与GM1对脊髓损伤后神经元凋亡及bcl-2基因的影响

目的:探讨甲基强的松龙(MP)与神经节苷脂(GM1)对脊髓损伤后脊髓神经元凋亡和bcl-2基因的影响及保护机制。方法:将85只同龄Wistar大鼠,采用Allens的weight dropping(WD)法挫伤大鼠T11节段脊髓,于术后即刻、15 min,4 h、8 h、12 h、24 h、72 h经蛛网膜下腔导管各注入MP与GM1,并与NaCl溶液组和正常对照组进行比较。结果:正常组脊髓前角中未发现凋亡细胞,NS组于伤后4 h始出现凋亡神经元。MP与GM1组与NS组相比较,凋亡神经元明显减少(P<0.01)。bcl-2基因在正常脊髓组织中表达很弱,在NS组中表达随时间不同,MP与GM1组bcl-2基因表达较NS组明显增加(P<0.01)。结论:脊髓损伤后脊髓神经元凋亡增多和bcl-2基因表达显著增多,MP与GM1能抑制脊髓损伤后脊髓神经元凋亡和上调bcl-2基因表达,从而保护损伤的神经组织。     

Antiepileptic drug-induced multidrug resistance P-glycoprotein overexpression in astrocytes cultured from rat brains

Background Intractable epilepsy may be due to multidrug resistance induced by conventional antiepileptic drugs. The phenomenon is sometimes associated with an overexpression of multidrug resistance gene 1 ( MDR1 ). The purpose of this study was to determine if the overexpression of MDR1 could be induced in astrocytes from rat brains in vitro using antiepileptic drugs.Methods Astrocyte cell cultures from postnatal Wistar rats (within 24 hours of birth ) were established. Different concentrations of the antiepileptic drugs phenytoin, phenobarbital,carbamazepine, and valproic acid were added to the cultures for 10, 20, or 30 days. The expression of P-glycoprotein (Pgp), the protein product of MDR1, was investigated with immunocytochemistry.Results Less than 5% of normal, untreated astrocytes had detectable Pgp staining at any time point. Phenytoin, phenobarbital, carbamazepine, and valproic acid induced the overexpression of Pgpin astrocytes in a dose- and time-dependent manner. Significantly higher levels of Pgp staining were detected at therapeutic concentrations of certain antiepileptic drugs (20 μg/ml phenobarbital, 40μg/mlphenobarbital, and 20μg/ml phenytoin) on day 30. Upregulation of Pgp was detected when using higher concentrations of phenytoin, phenobarbital, and valproic acid on day 20 and when using higher concentrations of any of the four antiepileptic drugs on day 30.Conclusions Treatment with antiepileptic drugs may contribute to the overexpression in astrocytes of MDR1 and its protein product, Pgp. The mechanism leading to MDR must be considered in patients under qoinq lonq-term treatment with antiepileptic drugs.     

基因芯片技术检测NOB1对骨肉瘤细胞相关基因的调控作用

目的：探讨应用基因芯片技术筛选出可能受NOB1调控的基因,阐明NOB1对骨肉瘤细胞相关基因表达的调控作用。方法：应用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰技术建立抑制NOB1 mRNA表达的Lv-shNOB1-U2OS骨肉瘤细胞株,实验分为2组,分别为对照病毒液感染U2OS骨肉瘤细胞（Lv-shCon-U2OS）组和含NOB1干扰质粒病毒感染U2OS骨肉瘤细胞（Lv-shNOB1-U2OS）组。利用mRNA表达谱芯片对Lv-shCon-U2OS组和Lv-shNOB1-U2OS组细胞分别行表达谱分析,并利用生物信息学数据库肿瘤基因（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）预测miRNA参与调控的生物学过程、细胞组分、分子功能和信号通路。结果：mRNA表达谱芯片数据显示,NOB1干扰后共有792个基因mRNA表达水平上调,1059个基因mRNA表达水平下调,总共差异变化基因为1851个。GO分析,从细胞位置条目的富集程度来看,差异基因编码产物蛋白主要分布于细胞质膜上,占总差异基因的56.9%,分布于细胞外区域的差异基因编码产物蛋白占总差异基因的39.4%,分布于细胞外空间占总差异基因的20%;从分子功能条目的富集程度来看,差异基因编码产物蛋白主要功能为钙离子结合相关功能（占总差异基因的22%）,其次功能为转运子活性（占总差异基因的9.2%）,第3位功能为肌动蛋白结合活性,（占总差异基因的8.7%）;从生化过程条目的富集程度来看,差异基因编码产物蛋白主要参与过程为信号转导（占总差异基因的18.7%）,其次参与过程为多种细胞器的生成（占总差异基因的15.6%）,第3位过程为细胞黏附过程（占总差异基因的10.2%）;KEGG分析,差异分子所编码的蛋白涉及领域包括细胞质膜成分、钙离子结合活性以及信号转导过程。结论：敲除NOB1可以对骨肉瘤细胞相关基因表达产生全方位的影响。     

重组变形链球菌V+蛋白的表达和纯化

目的：探讨变形链球菌表面蛋白可变区（V＋）基因在大肠杆菌中高效诱导表达及其表达产物的进一步纯化。方法：将V＋基因以C端融合6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。His6融合表达产物经金属离子（Ni^2 )融体亲和层析分离纯化，SDS－PAGE电泳和Western blot印迹分析表达产物。结果：SDS－PAGE分析确定有与His6融合表达产物（His6-rV )理论相对分子质量一致的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白的20％左右，表达产物以可溶形式存在。进一步纯化目的蛋白，纯度可达90％。Western blot实验表明表达产物具有良好的抗原性。结论：His6融合表达载体可以高效地表达和纯化重组V＋蛋白。     

鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因转染小鼠黑色素瘤B16F1细胞

目的：探讨基因转移载体脂质体介导转染的鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF)基因在B16F1细胞的表达动态及表达产物的生物活性。方法：脂质体和质粒DNA复合，转染10^6 B16F1细胞，连续5d换细胞培养液，并检测其中的mGM-CSF含量。采用[^3HTdR]渗入法，测定DA1G细胞和转染后第一天收获的以1：10对倍稀释到1：640的上清液及[^3HTdR]混合培养后，渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)，以分析表达产物的生物活性。结果：转染B16F1细胞的mGM-CSF基因得到有效表达。但随着时间的推移，表达由第1天的135ng/ml下降到第5天的42.2ng/ml。渗入到DA1G细胞的[^3HTdR]量（cpm)随上清液的稀释而逐步下降，由1：10稀释度的9371下降到1：640时的3251。和DMEM混合培养的DA1G细胞的[^3HTdR]渗入量（cpm)仅为472。结论：脂质体作为基因转移载体可有效地介导mGM-CSF基因转染B16F1细胞，并获得有生物活性的表达。     

pcDNA 3.0-tyr转染GM细胞及鉴定

目的 研究peDNA 3．0-tyr在正常人成纤维母细胞株（GM0639细胞）中的表达。方法 peDNA 3．0-tyr真核表达质粒扩增、纯化后经测序、酶切鉴定；电穿孔法将peDNA 3．0-tyr转染GM细胞，RT．PCR检测；测定490nm吸光度值，细胞爬片Fontana染色，证实酪氨酸酶基因表达及其表达水平。结果 测序及酶切结果提示peDNA 3．0-tyr质粒含有酪氨酸酶全长eDNA片段；转染peDNA 3．0-tyr的细胞的PCR产物长度与预期长度一致，而转染peDNA3．0空载体的细胞PCR产物无此条带；转染peDNA 3．0-tyr的GM细胞的A490显著高于转染空载体的细胞及未转染的GM细胞（P〈0．001）；转染peDNA 3．0-tyr的GM细胞Fontana染色于胞浆内见棕褐色银沉着颗粒，而转染peDNA3．0空载体以及未转染的细胞缺乏此颗粒。结论 peDNA 3．0-tyr可体外转染GM0639细胞并成功表达，为后续研究奠定基础。