三种不同的DNA分型技术在158株结核杆菌研究中的应用

目的评价IS6110限制性片段长度多态性(RFLP)、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及分枝杆菌散在重复单位(MIRU)三种分型方法在结核病流行病学研究中的应用。方法对158株结核分枝杆菌临床分离株应用IS6110RFLP、Spoligotyping及MIRU三种分型方法进行鉴定。结果应用三种分型方法产生的类型数分别为118、20和105个。IS6110RFLP的分辨率大于Spoligotyping,MIRU的分辨能力与IS6110RFLP接近。在MIRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性。广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义(P<0.05),广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论应用IS6110RFLP、Spoligotyping及MIRU三种分型方法进行结核病流行病学研究具有重要意义且非常有效,可以发现中国不同地区菌株的不同特点。     

70株浙江省结核分枝杆菌临床分离株Spoligotyping基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌临床分离株相关基因型的分布情况，并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集浙江省结核分枝杆菌临床分离株，常规罗氏培养基培养，应用Spoligotyping进行基因分型研究，聚类分析采用BioNumerics软件，统计学分析采用卡方检验。结果70株浙江省结核分枝杆菌临床分离株可分为2个基因群，即北京家族（Beijing family）和非北京家族（Non-Beijing family），分别占70％（49／70）和30％（21／70），18种基因型，其中12株为独特类型，剩余58株分为6簇。北京家族菌株中，89．8％（44／49）为典型北京家族（typical Beijing family），非北京家族菌株表现为高度的基因多态性，可分为13个基因型，9株为独特的基因型。北京家族菌株中表现为全敏感者71．4％（35／49），表现为耐药者为28．6％（14／49）；而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66．7％，表现为耐药者为33．3％，经卡方检验，两者问的差异无统计学意义（X^2=0．158，P〉0．05）。结论北京家族菌株为浙江的流行优势菌株。北京基因犁与耐药无明显相关性。     

应用Spoligotyping技术对吉林省结核分枝杆菌基因分型的研究

目的 使用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）对吉林省333株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型。方法收集吉林省内结核分枝杆菌临床分离株，应用Spoligotyping方法进行基因分型研究。基因聚类分析采用BioNumerics软件。结果共在吉林省内收集到333株结核分枝杆菌临床分离株，可分为2个基因群，即北京家族（Beijingfamily）或称北京基因型（Bering genotype），非北京家族（non—Beringfamily），分别占89．5％（298／333）和10．5％（35／333），29种基因型。其中22株为独特类型，余311株分为7簇。北京家族菌株中，95．0％（283／298）为典型北京家族，非北京家族菌株表现为高度的基因多态性，可分为19个基因型，16株为独特的基因型。结论吉林省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。     

河南省结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型技术的应用研究

目的研究间隔区寡核苷酸序列(Spoligotyping)基因分型技术在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省基因型种类和分布以及北京家族基因型在河南省的分布特征。方法应用2007年在河南省结核病防治机构实验室分离培养的310株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术对结核分枝杆菌进行分型检测分析,基因分型分析经http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces网站分析,统计学数据经卡方检验。结果对310株结核分枝杆菌临床分离株的Spoligotyping结果显示分为4个基因群(Beijing和Beijing近似群、T群、Manu群、S群),24个基因型,有267株为北京家族基因型,占86.1%,且北京家族基因型与MDR耐药有相关性;河南省较年轻人群(<60岁)感染的结核分枝杆菌中,北京家族基因型所占比例高于年老组(即>60岁组),北京家族基因型与年轻组的联系强于年老组;北京家族基因型的分布在不同的地区间有差异。结论河南省结核分枝杆菌以北京家族基因型为主要流行型,且与耐药及年龄、地域有相关性,重点监测北京家族基因型。     

聚合酶链反应扩增指纹多态性快速分型技术在部队结核病分子流行病学研究中的应用

目的 探讨南方部队结核病的分子流行病学规律。方法 设计一对特异性IS6110外向性引物，应用聚合酶链反应(PCR)建立检测结核分支杆菌DNA指纹多态性的方法，分析结核分支杆菌DNA多态性与流行病学的关系。结果 共检测分析了154株结核分支杆菌DNA的指纹多态性。根据这些菌株的指纹多态性特征共分为8个类型，以Ⅰ型(36．4％)、Ⅱ型(31．8％)和Ⅲ型(21．4％)为主，其余各型均少于4％。以20—29岁和30—39岁组在这三型中所占比例最大，分别为31．8％和27．9％。驻城镇部队与驻乡村部队以及结核病患者有无卡介苗接种史，在这三型的分布差异无显著统计学意义(P＞0．05)。但初治与复治患者分离菌株的PCR扩增指纹类型的分布差异有显著统计学意义(P＜0．05)。所检测菌株是否具有耐药性，在这三型中的分布差异也有显著统计学意义(P＜0．05)。菌株耐药主要为单耐异烟肼和利福平，耐药菌株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中所占比例分别是44．4％、29．6％和14．8％。结论 PCR扩增指纹多态性分型技术是一种简便、快速、敏感、特异和重复性好的分型方法，可用于结核病的分子流行病学研究。南方部队结核分支杆菌的传播以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型为主，应加强此三型菌株流行的监控。     

中国部分地区结核分枝杆菌北京基因型菌株分布初步分析

目的初步了解结核分枝杆菌北京基因型菌株在中国不同地区的分布情况。方法采用间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)方法对1 603株分离自7个省、市、自治区的结核分枝杆菌进行分型分析,确定北京基因型菌株在不同地区所占的比例。结果根据Spoligotyping分型结果及北京基因型菌株的定义,1 603株结核分枝杆菌中1 158株为北京基因型菌株,占72.24%。北京地区北京基因型菌株所占的比例最高为92.59%,其后依次为西藏(90.38%),吉林(89.88%),陕西(80.00%),新疆(65.36%),广西(55.29%),福建(54.50%)。结论北京基因型菌株为主要的流行菌株,但是不同地区北京基因型菌株所占的比例并不相同,北方地区北京基因型菌株的比例高于南方地区。     

江苏农村地区结核杆菌基因分型及耐药性分析

目的 研究江苏省农村地区分离的结核分枝杆菌基因多态性,从而了解菌株基因型与耐药之间的相关性。方法 采用罗氏培养基分离来自结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌,进行间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)和比例法进行4种一线抗结核药物的药敏试验。经统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果 547株结核分枝杆菌的Spoligotyping分型结果通过与SpolDB4.0数据库比对后显示,试验菌株被分为18个簇,57个基因型,以北京基因型菌株为主,占79.89%,非北京家族菌株包括T(T1、T2)、U、H、 MANU2、LAM10-CAM和CAS-DELH1等型别,各占11.15%、0.91%、0.37%、0.91%、0.18%和0.18%,以及26个型别(35株菌)为“新型”。药敏试验发现,总耐药率为21.94%,耐多药率为7.68%;单药耐药中,主要以链霉素和异烟肼耐药为主。经χ2检验和Fisher确切概率法分析发现,北京基因型与非北京基因型菌株的耐多药性方面差异具有显著统计学意义。结论 江苏省农村分离的结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,北京基因型为主要流行型,并且北京家族菌株与耐多药之间具有一定的相关性。     

结核分枝杆菌传播的分子流行病学特征

目的探讨结核分枝杆菌传播的基因型特征及其对于耐药结核菌近期传播的影响。方法选取13个社区作为监测点,应用分枝杆菌散在重复单位(MIRU)技术分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果 558株结核分枝杆菌的12个MIRU位点检测产生143个基因型,其中成簇基因型66个,成簇率86.2%;74.6%的菌株属于北京家族,177个菌株(31.7%)属于山东基因型;耐多药菌株的近期感染估计值(46.7%)明显低于全敏感菌株(72.7%)。结论山东基因型菌株具有较强的在人群中传播的能力、较高的耐药性以及对抗督导化疗的能力;利用基因分型技术开展结核病监测可以有效促进结核病控制工作。     

间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法收集224株结核分枝杆菌临床分离株,分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用。结果使用Spoligotyping方法,224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型,39株具有独特的基因型,其余185株菌呈现出16种基因型;使用MLVA方法时,224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型,132株具有独特的基因型,余下的92株菌呈现出28种基因型;当两种方法联合使用时,224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型,159株结核分枝杆菌具有独特的基因型,余下的65株菌表现为20种基因型。湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义(P<0.001),安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省。结论MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面,其分辨能力高于Spoligotyping,但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势。将Spoligotyping方法作为一线分型技术,MLVA作为二线分型技术联合应用时,将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。不同地区的菌株有不同的特点。     

18株耐药结核分枝杆菌散在分布重复单位基因型分析

目的:了解宁波市江北区流动人口结核耐药菌株的基因型,为探讨流行病学传播规律,正确制定防控策略提供依据。方法:随机抽取江北区流动人口分离的耐药结核分枝杆菌22株,先用PCR检测耐药基因,再对耐药菌株进行MIRU基因分型,同时对12个MIRU位点的多态性进行比较。结果:随机抽取的22株耐药菌株中耐药基因阳性18株,MIRU分型结果有18种MIRU基因型,12个MIRU位点的h值为0.73～0.88之间,显示了较高的多态性(h>0.6)。结论:江北区流动人口肺结核耐药菌株MIRU基因型呈"唯一性",说明发病以内源性、散发为主。MIRU分型简单快速有效。     

MIRU-VNTR和Spoligotyping用于重庆地区210株儿童结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的 评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和基于结核分枝杆菌散在分布数目可变串联重复序列分析(MIRU-VNTR)方法在重庆地区儿童结核病分子流行病学中的应用.方法 收集重庆地区210株儿童结核分枝杆菌(MTB)临床分离株,应用上述两种分型方法进行比较分析.结果 采用Spoligotyping分型方法,210株菌可分为2个基因群44种基因型,其中最大的1个基因群即北京家族(北京基因型)含有130株菌(61.90%).采用MIRU-VNTR分析发现24个位点的多态性差异较大,不同MIRU位点组合(12、15和24位点)的分辨率指数依次升高,后两个组合的差异是由位点ETR-B引起.各位点和各位点组合在北京家族菌株中的分辨率指数均高于非北京家族菌株.结论 重庆地区儿童MTB具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族.在结核病原学监测中,可先采用Spoligotyping,再对成簇菌株进行15位点与ETR-B组合二次分型的联合分型策略,可提高分子流行病学调查效果.

Abstract：

Objective To evaluate the application of spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) and mycobaeterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat (MIRU-VNTR) analysis in the molecular-epidemiological study of tuberculosis and to discuss the characteristics of pediatric Mycobacterium (M.) tuberculosis strains in Chongqing. Methods M. tuberculosis strains isolated and typed by Spoligotyping and MIRU-VNTR respectively, from the children patients in Chongqing and to compare the results from both methods, epidemiologically. Results By means of Spoligotyping, 210 clinical isolates were divided into 2 gene groups, displaying 44 genotypes. Among them, the biggest group was M. tuberculosis Beijing family, including 130 strains (61.90%) ,using the Spoligotyping. From the results of MIRU-VNTR, 24 loci showed different polymorphism and the HGI of different loci set (12 old loci, 15 basic loci and 24-loci set) increased accordingly. The subtle difference in HGI was originated from one locus ETR-B, which was included in the 24-locus system. The diversity of each loci and MIRU-VNTR set for non-Beijing genotype strains was higher than that of the Beijing genotype strains. Conclusion In this study, it was preliminarily confirmed the existence of high polymorphism of M. tuberculosis while the Beijing Family was the main genotype and main prevalent strain in children of Chongqing area. Spoligotyping prior to 15-locus with ETR-B combination seemed more suitable for the massive epidemiological investigation of pediatric tuberculosis patients.     

13个VNTR位点用于113株结核分支杆菌的基因分型研究

目的 应用数目可变串联重复序列（VNTR）分子分型技术，对北京地区113株肺结核临床分离菌株进行分型研究，探讨北京地区菌株DNA多态性和基因型特征。方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分支杆菌13个VNTR位点进行检测，并应用Gel-Pro analyzer 3．1软件和BioNumerics3．0软件进行结果分析。结果 113株结核分支杆菌可分为4个基因型（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型占92．0％（104/113），其他3型所占比例很小，分别为Ⅱ型占4．4％（5／113），Ⅳ和Ⅴ型均为1．8％（2／113），而标准菌株H37Rv在分型中为独立的一个基因型，即Ⅲ型。结论 北京地区的结核分支杆菌存在基因多态性，其主要流行型为Ⅰ型。     

中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型方法标准化操作程序的探讨

目的 探讨中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)的标准化方法,初步评价其应用价值.方法 采用核酸提取、聚合酶链反应(PCR)、反向线性点杂交等技术,结合BioNumeries(Version 5.0)软件,对224株结核分枝杆菌临床分离株进行分型研究.结果 使用Spoligotyping标准化方法 对224株中国结核分枝杆菌临床分离菌株进行基因分型,将其分为北京家族菌株和非北京家族菌株两大簇.其中北京家族菌株129株,为主要的流行菌株.结论 初步确定中国Spoligotyping标准化技术方案.该方法 快速、简便、重复性好,能同时对结核分枝杆菌进行检测和分型,有利于结核病传染源的追溯和流行趋势的研究,尤其是在鉴定北京家族菌株上具有独特作用.     

四川省结核分枝杆菌VNTR分型研究

目的评价不同串联重复序列(VNTR)位点在四川省结核分枝杆菌中的基因多态性,以及不同VNTR位点组合在四川省结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法采用多位点数目可变串联重复序列分析技术(ML-VA)对102株四川省结核分枝杆菌菌株的15个VNTR位点进行分析,基因多态性分析采用Hunter-Gaston指数,聚类分析采用BioNumerics软件。结果 15个VNTR位点的基因多态性存在较大的差异,位点Mtub21(HGI 0.772)和MIRU26(HGI 0.764)的多态性较高,ETR-C(HGI 0.168)和MIRU23(HGI 0.077)的多态性较差。ETR-B和ETR-C两个位点在对四川省北京基因型结核分枝杆菌进行分型时则不具有多态性。对不同的VNTR位点组合进行比较,随着VNTR位点的增加,VNTR分型方法的分辨能力也有所提高。10个VNTR位点组合的分辨指数与15位点组合的分辨指数相差不大。同一VNTR位点在不同地区北京基因型菌株中的分辨力也存在较大的差异。结论不同VNTR位点在四川省结核分枝杆菌中具有不同的分辨力,并且同一VNTR位点在不同地区的北京家族菌株中的分辨力也不同。10个VNTR位点组合的基因分型方案可用于四川省结核分枝杆菌基因分型的一线方法。本研究的数据结果对挑选适合中国结核分枝杆菌基因分型的VNTR位点组合法具有重要的作用。     

厦门市临床分离的466株结核分枝杆菌基因分型研究

目的 了解厦门市结核分枝杆菌基因类型分布及主要流行基因群情况,并建立分型数据库。方法 采用实时荧光PCR法对厦门市2013 - 2015年分离到的466株结核分枝杆菌临床分离株进行菌株确认,然后采用间隔区寡核苷酸分型方法（spoligotyping）对其进行基因分型。分型结果与SpolDB4数据库进行比对,并使用Bionumeric6.6.4软件进行基因聚类分析。结果 466株菌均为结核分枝杆菌,基因分型分成96种基因型别,62种数据库中有相应的SIT编号,34种为新的型别。97.64%(455/466)的菌构成了15个基因簇。466株菌属于7个基因家族及未定义家族,排在前三的分别为:Beijing（北京）家族60.09%（280/466）、T家族21.03%(98/466)、H家族5.58%(26/466)。结论 厦门市结核分枝杆菌基因型别呈现多样性,北京家族为主要的流行基因群。