基因修复与转座子介导的基因治疗

目前的基因治疗多采用基因增补的方法。基因增补存在的大量缺陷致使遗传性疾病和获得性基因紊乱性疾病的治疗方法不断发展。基因修复就是从同源性基因重组中派生出来的，它包括原位突变基因的矫正及基因正常功能的恢复。本文综述点特异性基因修复的优缺点，重点介绍嵌合RNA／DNA寡聚核苷酸、单链及三链形成寡聚核苷酸、小片段同源基因置换及一种全新的无病毒基因增补技术——“睡美人”转座子系统。     

99mTc-MDR1寡聚核苷酸DNAs的制备及质量控制

研究99mTc标记多药耐药基因(MDR1)mRNA反义DNAs寡聚核苷酸及其正义DNAs寡聚核苷酸的最佳标记方法并制备其二步法冰冻试剂盒,完成99mTc标记MDR1反义DNAs寡聚核苷酸和正义DNAs寡聚核苷酸及其二步法冰冻试剂盒的的质量控制.合成20个碱基单链的MDR1 mRNR的反义DNA寡聚核苷酸(ASON)及其正义DNA寡聚核苷酸(SON),全程硫代修饰并在5′末端附加氨基酸以修饰,分别将ASON和SON DNA 与MAG3偶联后用99mTc标记,制备了99mTc-寡聚核苷酸DNA二步法冰冻试剂盒.通过改变ASON-和SON-MAG3 DNAs、氯化亚锡及缓冲液的用量,调整反应介质的pH值条件,探讨其最佳标记方法.用高压液相色谱仪(HPLC)测定该药盒化合物的放射化学纯度、标记物的体内外稳定性、药盒的稳定性.99mTc-ASON-和SON-MAG3 DNAs标记化合物的放射化学纯度＞92%,标记物室温放置24 h后其放射化学纯度＞90%;药盒在-20℃条件下放置6个月,标记物的放射化学纯度仍＞90%.99mTc-寡聚核苷酸DNAs二步法冰冻试剂盒性能优良,标记方法简单、可行、有效,且标记物稳定性良好.     

Tc-MDR_1寡聚核苷酸DNAs的制备及质量控制

研究99mTc标记多药耐药基因(MDR1)mRNA反义DNAs寡聚核苷酸及其正义DNAs寡聚核苷酸的最佳标记方法并制备其二步法冰冻试剂盒,完成99mTc标记MDR1反义DNAs寡聚核苷酸和正义DNAs寡聚核苷酸及其二步法冰冻试剂盒的的质量控制。合成20个碱基单链的MDR1 mRNR的反义DNA寡聚核苷酸(ASON)及其正义DNA寡聚核苷酸(SON),全程硫代修饰并在5′末端附加氨基酸以修饰,分别将ASON和SON DNA与MAG3偶联后用99mTc标记,制备了99mTc-寡聚核苷酸DNA二步法冰冻试剂盒。通过改变ASON-和SON-MAG3 DNAs、氯化亚锡及缓冲液的用量,调整反应介质的pH值条件,探讨其最佳标记方法。用高压液相色谱仪(HPLC)测定该药盒化合物的放射化学纯度、标记物的体内外稳定性、药盒的稳定性。99mTc-ASON-和SON-MAG3 DNAs标记化合物的放射化学纯度>92%,标记物室温放置24h后其放射化学纯度>90%;药盒在-20℃条件下放置6个月,标记物的放射化学纯度仍>90%。99mTc-寡聚核苷酸DNAs二步法冰冻试剂盒性能优良,标记方法简单、可行、有效,且标记物稳定性良好。     

增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展

<正>CpG基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为6个寡聚核苷酸。1995年,Krieg等[1]研究发现非甲基化的CpG二寡聚核苷酸是病原体DNA免疫刺激活性的结构基础,自此,对CpG基序的各种研究得以展开,包括CpG基序免疫刺激机制、CpG基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等。含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸作为一种免疫增强剂,在体内和体外均表现免疫刺激作用,可以引起先天性免疫反应。CpG在体内能引起明显且多样化     

微量DNA体外扩增及顺序特异的寡聚核苷酸探针作HLA-DQA基因分型

本文用人的微量DNA作PCR体外扩增,将PCR产物用5种特异的寡聚核苷酸探针进行分子杂交及HLA-DQA基因分型。实验结果与血清学检测的DR抗原结果完全一致,从而表明HLA-DQ基因与DR基因之间存在着较强的相关性。该方法具有敏感度高、技术稳定和样品微量等特点,是目前用于分子水平检测HLA基因的一项先进技术。     

营养组合物对再生障碍性贫血大鼠基因损伤的修复作用

目的研究营养组合物对再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)大鼠基因损伤修复的影响,探讨其治疗再生障碍性贫血的作用机制。方法选取SD大鼠,随机分为正常对照组,再障模型组,营养组合物高剂量组,中剂量组和低剂量组。留取各组大鼠肝脏、骨髓、脑组织,采用RT-PCR法分析各组织修复基因表达情况。结果(1)营养组合物对再障大鼠肝脏组织中核苷酸切除修复基因Xpc、骨髓和脑组织中核苷酸修复基因Ercc2及碱基切除修复基因Ogg1、MTH1具有损伤修复作用;(2)营养组合物对再障大鼠肝脏、骨髓及脑组织中错配修复基因MSH2、MSH3、MLH1、PMS2具有损伤修复作用;(3)营养组合物对再障大鼠肝脏、骨髓及脑组织中重组修复基因Rad51、Rad52、Xrcc1具有损伤修复作用;(4)营养组合物对再障大鼠肝脏及骨髓SOS修复基因Rec A具有损伤修复作用。结论营养组合物对再障大鼠肝脏、骨髓、脑组织基因损伤具有修复作用,为治疗再生障碍性贫血提供理论依据。     

在DNA特异位点上由三股螺旋导致的交叉连接抑制基因表达

人工合成的寡聚脱氧核苷酸是研究生物体系内基因抑制的理想工具。能与DNA双链结合形成三股螺旋的寡聚脱氧核苷酸具有特殊意义,因为它是与基因本身结合,而不是象在及意义策略中与基因的产物mRNA结合。将能形成三股螺旋的寡核苷酸与修饰DNA的试剂偶联后可用于引起靶DNA以高度序列特异性的方式发生修饰。我们最近设计了补骨脂素-寡核苷酸的结合物,它一旦通过形成三股螺旋与双链DNA结合后,即能在体外与经过紫外线照射的DNA的二条链发生交叉连接。一种补骨脂素-寡核苷酸的结合物被导向白介素2受体α亚     

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

99mTc-反义寡聚核苷酸DNA肿瘤显像的实验研究

拟探讨放射性标记反义寡聚核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASON)DNA在荷瘤裸鼠体内显像的可行性。采用两种不同肿瘤细胞系KB-G2和KB-31,并肿瘤内注射的方法;设立ASON的对照正义寡聚核苷酸(Sense oligonucleotide,SON);用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所用经MAG3偶联的寡聚核苷酸的杂交活性;完成99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON DNA肿瘤内注射后在荷瘤裸鼠体内的显像及其生物分布研究。经MAG3偶联的寡聚核苷酸与天然寡聚核苷酸具有相同的杂交活性。在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内,99mTc-MAG3-ASON DNA的分布明显高于其对照99mTc-MAG3-SON DNA的分布(14.7vs8.5%ID/g)。但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内,两者的分布无显著性差异(8.6vs4.3%ID/g)。全身显像显示99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布增高,但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布则未见显著性差异。结果表明:99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷瘤裸鼠肿瘤内的分布有显著性统计学差异,本研究证实了活体动物体内肿瘤反义显像的可行性。     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制卵巢癌细胞株SKOV3／mdr1中MDR1基因的表达

多药耐药基因（MDR1）编码的P－糖蛋白(Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要因素之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－AS）通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3／mdr1 细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－S)同样导入细胞为对照。经以脂质体介导的1．6μmol/L MDR1-AS转染后,Pgp阳性的细胞百分数从100％降至48．7％,经过16和10μmol／L两个浓度的单纯MDR1－AS转染后,Pgp阳性细胞的百分数也从100％分别降至52．6％和86．7％。同时,利用RT－PCR检测了MDR1mRNA水平的变化,以β-actin作为内对照,发现MDR1mRNA水平在MDR1－AS转染后降至内对照的60％左右,而用MDR1－S转染的细胞与SKOV3／mdr1细胞比无明显变化。所以导入MDR1基因硫代反义寡聚脱氧核苷酸可以部分抑制SKOV3／mdr1细胞中MDR1基因的表达。     

探讨人胶质瘤细胞系U87细胞中反义miR-21诱导凋亡机制

目的 探讨下调miR-21诱导人胶质瘤细胞系U87细胞凋亡机制.方法 应用化学方法合成的反义miR-21寡聚核苷酸(anti-miR-21),通过瞬转法转染U87细胞,检测U87细胞凋亡、增殖、侵袭等变化,并结合生物信息学分析、Western印迹验证在U87细胞中miR-21和PTEN基因及caspase间关系.结果 体外转染反义miR-21寡聚核苷酸能明显抑制U87细胞生长,诱导其凋亡,降低侵袭能力;增加caspase-3表达活性,活化caspase-9表达,但不影响PTEN和caspase-8表达.结论 miR-21可能是人胶质瘤U87细胞的抗凋亡微RNA(microRNA,miRNA),反义miR-21可能通过easpase-9、3而不是PTEN诱导肿瘤细胞凋亡.     

miR-122a 抑制人喉癌细胞株Hep2 细胞增殖的研究

目的:研究miR-122a 对人喉癌细胞株Hep2 细胞增殖、细胞周期以及相关蛋白表达量的影响。方法:人喉癌细胞株Hep2 细胞分别转染miR-122a 寡聚核苷酸(A 组)和miR-122a inhibitor(阻遏物)(B 组),同时设立阻遏物阴性对照( inhibitor negative control,miR-NC inhibitor)(C 组)和空白对照(D 组)。用RT-PCR、MTT 法、流式细胞仪和Western blot 技术评价各组细胞增殖和细胞周期的生物学特征。结果:转染miR-122a 寡聚核苷酸后,Hep2 细胞中miR-122a 表达显著增加。同D 组相比,A 组细胞增殖水平明显受到抑制,miR-122a 寡聚核苷酸能够有效诱导Hep-2 细胞周期阻滞在G1/ G0 期,A 组细胞分裂周期蛋白42 表达水平明显下调,细胞周期调控因子蛋白CDK4 及细胞周期素D1 蛋白表达水平明显降低。结论:miR-122a 寡聚核苷酸能够显著抑制喉癌细胞Hep2 的增殖,miR-122a 是潜在的人喉癌细胞基因治疗的候选靶点。     

ERCC1基因在非小细胞肺癌中的作用

化疗是非小细胞肺癌治疗的主要手段之一,而耐药是影响化疗疗效的重要因素。切除修复交叉互补基因1是核苷酸切除修复的关键基因,其基因表达及基因多态性与铂类耐药存在相关性,从而影响非小细胞肺癌对化疗敏感性及疗效。     

NOD2基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌中的作用

为探究核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide binding oligomerization domain 2,NOD2)基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌免疫反应中的作用,应用siRNA干扰人巨噬细胞U937中NOD2的表达后用结核分枝杆菌感染U937细胞,采用菌落计数法检测U937细胞对结核分枝杆菌的吞噬及杀伤能...     

反义寡核苷酸对K562细胞株恶性表型逆转作用的研究

用人工合成的ｂｃｒ３／ａｂＬ２反义寡聚脱氧核苷酸（ＡＳＯ－ｂ）及无关寡聚脱氧核苷酸（Ｎ－ＯＤＮ）处理人急性红白血病细胞株Ｋ５６２细胞，结果造成了细胞恶性行为的改变。表现为细胞生长减慢、Ｐ２１０蛋白表达受抑、ＤＮＡ的合成减少及集落形成能力下降，从而证明了反义核酸在癌基因表达上的调控和抑制细胞恶性行为的作用。     

SELEX技术及其应用研究进展

SELEX技术是一类在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术,具有靶分子范围广,筛选出的配体亲和力和特异性高等特点.筛选出的特异寡聚核苷酸片段,不仅在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用,也为核酸结构和功能的研究提供了一个有效的方法.     

反义技术展望

反义技术是根据碱基互补原理,利用与靶ＤＮＡ或靶ＲＮＡ互补的短链寡聚核苷酸片段抑制基因表达的方法。反义技术,在理论上作一种完善的、特异性的方法阻断基因的表达,在短短的二十年野取得了迅速发展。本文将对反义技术、反义技术存在的问题及可能的解决方法、以及当前的义技术在医学中的应用进行阐述,本文将对反义技术未来的发展趋势进行讨论。     

DNA损伤修复基本方式的研究进展

DNA损伤修复基因可修复由不同原因导致的DNA损伤 ,从而保护遗传信息的完整性。DNA损伤修复有 3种基本形式 ,即碱基切除修复、核苷酸切除修复和错配修复。本文综述了DNA损伤修复 3种基本形式的研究进展情况并讨论了DNA链断裂重组和重接合修复及DNA聚合酶绕道修复DNA损伤     

含五碳丙炔嘧啶的寡聚核苷酸对基因的反义抑制

作者选用了以嘧啶五碳丙炔取代的硫代磷酸寡聚核苷酸(pU-pC,S-ODN)为主的一系列ODN衍生物,以SV40大T抗原(TAg)为靶基因进行了基因的反义抑制实验。同时,以E.coliβ-半乳糖苷梅(β—gal)为对照基因,用于检测ODN的抑制细胞和     

SELEX技术及其应用研究进展

SELEX技术是一类在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术，具有靶分子范围广，筛选出的配体亲和力和特异性高等特点。筛选出的特异寡聚核苷酸片段，不仅在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用，也为核酸结构和功能的研究提供了一个有效的方法。