雌激素与流体剪切力对成骨细胞增殖和功能的间接影响

目的 :了解雌激素与流体剪切力对体外培养的成骨细胞增殖和功能的间接影响 .方法 :进行新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞原代培养 .选择恒定的雌激素浓度及合适的振荡频率分四种组合方式施加于成骨细胞 ,2 4h后用其培养液培养静止状态下的成骨细胞 ,观察不同时间段细胞增殖和碱性磷酸酶活性的变化 .结果 :经雌激素和机械力影响的条件培养液作用 12h后 ,可促进细胞增殖 (P <0 .0 1) ,该效果持续至 2 4h ,在 2 4h至 72h两因素表现为协同作用 (P <0 .0 1) ;对ALP的活性的影响在 12h之前两因素表现为拮抗作用及抑制作用 (P <0 .0 1) .2 4h后 ,机械力可促进ALP活性升高 ,并持续至 72h .结论 :雌激素和流体剪切力及两者复合作用均可通过旁分泌方式影响细胞的增殖和功能     

流体剪切力影响成骨细胞生物学功能及分化机制的研究

摘　要：目的　 探讨流体剪切力（FSS）作用下成骨细胞生物学功能及分化机制。方法 4 组大鼠成骨细胞分别施 加 0、30、60 和 120 min FSS（12 dyn/cm2 ）刺激,免疫荧光染色后观察FSS刺激成骨细胞不同时间后的细胞骨架变化,采 用Image J软件计算细胞分形维数,比较细胞内部复杂程度;使用Ca2+试剂盒检测钙响应,碱性磷酸酶（ALP）测试盒检 测ALP活性;Real-time PCR检测FSS刺激不同时间后成骨细胞的BMP2、Runx2、Osterix（Osx）基因表达;Western blot 检测FSS刺激不同时间后成骨细胞的BMP2、Runx2、Osx蛋白表达水平,采用Quantity one进行光密度分析。结果 12 dyn/cm2 FSS刺激成骨细胞可引起细胞骨架形态、微丝丰富度及细胞复杂程度的变化,以 60 min最明显。与 0 min组相比, 细胞Ca2+浓度在FSS刺激 30 min后明显升高,延续至 60 min为高峰平台期（P<0.05）,120 min 后Ca2+浓度回落;60 min 组的BMP2、Runx2、Osx基因和蛋白表达水平均明显上调（P<0.01）;ALP活性升高,在刺激 60 min时最为明显（P<0.05）。 结论 12 dyn/cm2 FSS刺激能改善成骨细胞生物学功能,促进BMP2、Runx2、Osx基因及其蛋白表达上调;能通过改变成 骨细胞骨架促进Ca2+浓度升高,进而激活与分化高度相关的BMP2-Runx2-Osx信号通路,提高成骨细胞分化标志物ALP 活性。     

成骨细胞中NO及c-fos对流体剪切力的响应

目的：研究NO及c—fos对不同流体剪切力作用时间的生理响应。方法：分离新生SD大鼠颅盖骨中的成骨细胞并分成三组，分别使用含10％FBS、0．3mmol／L L—NMMA和0．1mmol／L SNP的DMEM培养液预处理24h，加载大小为1．2Pa的剪切力。每组在加载剪切力0min、10min、15min、30min、60min后分别测试c—fos mRNA、NOS的表达。结果：c—fos mRNA表达在水平剪切力加载15min时明显增高（P〈0．05），在使用L—NMMA后明显降低（P〈0．05），而使用SNP后明显升高（P〈0．05）。结论：c—fos和NO参与了力学刺激引发细胞响应的过程，特别是在外界信号刺激引起的信息传递级联反应中起重要的偶联作用。     

Piezo1介导的流体剪切应力通过增强细胞骨架重组上调成骨细胞增殖

目的：最近研究发现的Piezo1机械敏感性离子通道或许在骨质疏松的发生、发展过程中起相关作用。本研究探索流体剪切力(FSS)是否通过Piezo1离子通道对MC3T3-E1成骨细胞增殖产生作用。方法：使用本课题组自行研究设计的FSS加载装置,对MC3T3-E1成骨细胞加载不同强度(3、6、9、12、15、18dyne/cm²)流体剪切力,使用Western Blot方法观察促进Piezo1蛋白表达的最佳FSS条件,探究激活剂(Yoda1)和抑制剂(GsMTx4)对Piezo1表达的影响。使用Western Blot及EdU染色观察成骨细胞增殖变化。通过鬼笔环肽染色、免疫荧光以及EdU染色探究细胞骨架对成骨细胞增殖的影响。结果：在不同强度循环流体剪切力下,6dyne/cm²时成骨细胞内Piezo1蛋白表达量最高。激活剂Yoda1浓度在20μM作用3h上调细胞内增殖相关蛋白PCNA、MCM2、Cyclin D1表达,细胞增殖率明显增加;抑制剂GsMTx4浓度在0.5μM作用2h下调细胞内增殖相关蛋白PCNA、MCM2、Cyclin D1表达,细胞增...     

降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞表达转录因子RUNX2的影响

目的：探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法：用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增殖的有效浓度,将含有不同浓度CGRP的条件培养基加入大鼠成骨细胞培养体系中,药物作用48 h后,用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测大鼠成骨细胞转录因子RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。 结果：当CGRP浓度在10^-8～10^-6 mol/ L范围时,对成骨细胞增殖有明显促进作用,增殖率分别为71.9%,142.1%,321.0%,P<0.05;浓度为10^-7 和10^-6 mol/ L的CGRP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2在mRNA水平的表达量明显上调,分别增强(46.2±11.2)%和(58.6±14.0)%, P<0.05;转录因子RUNX2的蛋白表达变化趋势与其mRNA的表达变化趋势基本一致。结论：一定浓度的CGRP对大鼠成骨细胞转录因子RUNX2的表达有直接促进作用,RUNX2可能参与了CGRP刺激成骨细胞增殖反应的机制。     

沉默Pokemon基因对鼻咽癌细胞株CNE-2放射敏感性的影响

【目的】探讨沉默Pokemon基因对鼻咽癌细胞(CNE-2)放射敏感性的影响,寻求放射治疗鼻咽癌的新方法。【方法】首先利用siRNA预测软件得到3条siRNA序列,并制备合成siRNA片段,利用RT-PCR和免疫印迹法检测其沉默Pokemon基因的效果,筛选出沉默效果最佳的siRNA片段,转染CNE-2细胞后观察其对CNE-2细胞p53基因表达的影响、MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的凋亡、克隆形成法检测转染siRNA联合放射处理后细胞的放射增敏比。【结果】成功筛选出了沉默效应最佳的siRNA片段,转染CNE-2细胞后能显著降低其Pokemon基因的表达、提高p53基因的表达、降低细胞的增殖活性、加速细胞的凋亡,同时增加了CNE-2细胞的放射敏感性。【结论】沉默Pokemon基因能增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性,这为临床鼻咽癌的放射增敏治疗提供了新思路。     

金雀异黄素对成骨细胞增殖和分化的影响

目的 观察金雀异黄素对正常妇女成骨细胞增殖和分化的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝法,检测应用不同浓度金雀异黄素刺激成骨细胞增殖的情况,半定量RT-PCR及免疫组化法测定c-fos、c-jun基因及蛋白表达.结果 以浓度为0 mol/L的金雀异黄素为对照,10-10、10-8、10-6mol/L金雀异黄素增加人成骨细胞增殖达9.6%、14.4%、23.0%;金雀异黄素促进成骨细胞c-fos、c-jun基因及其蛋白的表达,表达呈剂量依赖性.结论 金雀异黄素可刺激成骨细胞增殖,增加c-fos、c-jun基因及其蛋白的表达.     

应力作用下成骨细胞的信号转导及基因调控

骨重建在很大程度上依赖于其所处的力学环境,这是存在于整个生命过程中的骨吸收与骨形成之间的一种动态平衡。成骨细胞（osteoblasts,OB）是骨组织中的重要细胞,在骨的形成、发育、改建、修复过程中发挥重要作用。利用力学装置作用于OB,模拟人体正常生理状态的力学环境,观察OB生物学效应、力学转导机制及基因调控是目前研究的热点。     

降钙素基因相关肽对兔成骨细胞增殖和TGF-β1表达的影响

目的 检测外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-ralated peptide,CGRP)对体外培养兔成骨细胞转化生长因子-β1(transformation growth factor-β1,TGF-β1)表达的调控作用,探讨其对成骨细胞增殖的影响.方法 将出生5d以内新西兰大白兔头骨成骨细胞进行原...     

氟对成骨细胞Saos-2 DNA甲基化的影响

目的 观察氟化钠(NaF)对成骨细胞的毒性效应,及在毒性作用过程中对DNA甲基化效应的影响.方法 0、2.5、5、10、20、40 mg/LNaF分别干预骨肉瘤细胞(Saos-2)24、48、72、96 h后,噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞的增殖活力;流式细胞仪法检测72 h细胞的增殖活力;基因芯片检测细胞的DNA甲基...     

条件性恐惧对部分脑区即刻早期基因c-fos表达的影响

目的观察条件性恐惧对大鼠部分脑区即刻早期基因c-fos表达的影响。方法采用条件恐惧训练诱导大鼠焦虑反应模型,免疫组化ABC方法结合计算机图像分析系统对大鼠中枢神经系统海马区和杏仁核区c-fos免疫阳性物质数密度进行测定。结果c-fos免疫阳性物质数密度:中央杏仁核对照组为(0.13±0.13),实验组为(2.71±0.32)(P<0.01);基底外侧杏仁核对照组为(0.00±0.00),实验组为(1.68±0.25)(P<0.01);海马对照组为(4.13±0.67),实验组为(3.51±0.97)(P>0.05)。结论条件恐惧训练后大鼠中央杏仁核和基底外侧杏仁核c-fos表达显著增加,海马区c-fos表达改变不明显。     

氯化甲基汞对不同发育阶段小鼠脑组织神经元c-fos基因表达的影响

目的:探讨氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC)对不同发育阶段小鼠大、小脑组织神经元c-fos表达的影响.方法:选用1、4、8、16、28天龄和成年(P1、P4、P8、P16、P28、AD)雄性昆明系小鼠,实验组腹腔注射10 mg*kg-1 MMC,对照组腹腔注射同体积的生理盐水,染毒后各天龄组小鼠按下述时间点在麻醉状态下取脑组织, P8组小鼠在30、45、60、120和180 min时间点及其余各组在45 min时间点迅速取脑组织,常规石蜡包埋,采用原位杂交法观察MMC对大、小脑神经元c-fos基因表达的影响.结果:P8小鼠大脑和小脑c-fos mRNA阳性细胞率在第30分钟时开始增加,45 min时间点最高,随着时间的延长逐渐减少;P8实验组45 min阳性表达率小脑高于大脑(P<0.05);45 min时间点实验组大脑和小脑c-fos mRNA阳性细胞率随小鼠天龄的增加而减少;P1、P4、P8天龄组大脑阳性细胞率高于对照组高(P<0.05);P1、P4、P8、P16、P28天龄组小脑阳性细胞率高于对照组 (P<0.05).结论: MMC可诱导小鼠大、小脑神经元c-fos基因表达,这可能是MMC神经损伤的机理之一.     

孕鼠被动吸烟对胎鼠脑组织c-fos基因表达的影响

目的探讨胚胎期被动吸烟对胎鼠学习能力的影响及其机制。方法采用反映学习记忆功能的水迷宫法测试仔鼠神经行为的改变;免疫组织化学染色法研究胎鼠脑组织中蛋白表达的水平。结果胚胎期被动吸烟使大鼠学习记忆能力下降。大脑皮质及海马区内均有较多的FOS蛋白阳性细胞。结论胚胎期被动吸烟对大鼠学习记忆能力有明显影响,且这种改变可能与脑组织的c-fos基因表达有关系。     

卡托普利对肾性高血压心肌肥厚大鼠左心室肌原癌基因c-fos mRNA表达的影响

探讨卡托普利对肾性高血压心肌肥厚大鼠左室肥原癌基因ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ表达的影响。方法：采用原位杂交方法检测原癌基因ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ的表达。结果经过８周治疗后,卡托普利使高血压心肌肥厚大鼠左室肌原部癌基因ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ表达量显著减少。结论卡托普利减少高血压心肌肥厚大鼠左室肥原癌基因ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ的表达。     

兔下颌骨牵张成骨组织中c-fos和OPG及OPGL的表达

目的:探讨在机械张力作用下骨细胞将生物力学信号转变为生物学效应的作用机理.方法:建立兔下颌骨牵张成骨模型,用免疫组化方法检测牵张中期(牵张第4天)、牵张末期(牵张第8天)与固定期2周、4周、6周的牵张区新生骨组织中c-fos、骨保护素(OPG)、破骨细胞分化因子(OPGL)的分布和表达.结果:在牵张中期和末期c-fos的表达为强阳性,明显强于固定期2周、4周、6周的组织.牵张中、末期和固定期2周组织OPG的表达为强阳性,在固定期4周、6周组织中逐渐减弱.OPGL仅在固定期6周组织中有较弱表达,其余各时间点均无明显阳性表达.结论:在下颌骨牵张新骨形成改建过程中,c-fos与机械力刺激关系密切,OPG能促进新骨形成,而OPGL则与骨改建有关.     

强迫游泳应激强度的改变对大鼠海马中c—fos表达习惯化的影响

目的 研究应激强度的改变对重复应激导致的大鼠海马中c—fos表达习惯化的影响。方法 采用特异抗体的免疫组织化学方法，在重复强迫温水游泳应激导致的c—fos表达习惯化大鼠模型基础上，观察强迫冰水游泳应激对大鼠海马中c—fos表达的影响。结果 重复强迫温水游泳应激导致c—fos表达习惯化后，再给予强迫冰水游泳应激使c—fos表达水平再次升高。结论 高强度的应激可以逆转低强度应激所引起的习惯化效应。     

鞘内注射咪唑安定对福尔马林致痛大鼠脊髓c-fos表达的影响

目的：研究鞘内注射咪唑安定对福尔马林致痛大鼠脊髓c-fos表达的影响。方法：雄性SD大鼠32只，随机分为4组（n=8）：对照组（C组）、模型组（F组）、生理盐水组（NS组）及咪唑安定组（M组）。鞘内置管后5d，F组、NS组及M组大鼠于左后足掌部皮下注射5％福尔马林100μL，注射福尔马林前20min，NS组鞘内注射20μL生理盐水，M组鞘内注射4μL（20μg）咪唑安定和16μL生理盐水，C组足底注射生理盐水100μL。采用疼痛加权评分评价疼痛行为学，并在足底注射后2h后将所有动物处死取脊髓膨大处，采用免疫组织化学法观察脊髓背角c—fos表达。结果：与C组比较，F组、NS组脊髓背角c－fos表达增加（P〈0．01）；与F组、NS组比较，M组脊髓背角c—fos表达降低（P〈0．01）。结论：鞘内注射咪唑安定可抑制福尔马林炎性疼痛引起的脊髓中c－fos表达增加，可能与咪唑安定的抗伤害和镇痛作用有关。     

RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞株MG63增殖影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法 选用人骨肉瘤细胞进行体外培养,以siRNA分别处理MG63细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3和C-myc蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对MG63细胞增殖有抑制作用.下调bcl-2的表达的同时,上调了caspase-3蛋白表达水平,并使C-myc蛋白表达水平下调.对bcl-xl、bax的蛋白表达无明显影响.结论 RNA干扰显著降低bcl-2蛋白的表达,对人骨肉瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用.     

大鼠脑损伤时神经细胞c-fos 、c-jun和c-myc基因表达变化

目的观察大鼠脑损伤后不同时间皮质神经细胞早期快反应基因c-fos 、c-jun和c-myc表达变化.方法应用Northern杂交、原位杂交和免疫组织化学方法检测皮质神经细胞中c-fos、c-jun和c-myc的表达.结果脑损伤后15 min,伤侧皮质神经细胞出现上述3种基因mRNA的表达,随时间的延长,表达逐渐增加,于伤后3 h达高峰并持续至伤后24 h,伤后72 h恢复至对照水平.c-fos和c-jun蛋白表达亦于伤后15 min出现,c-myc蛋白表达于伤后30 min出现,并均于伤后3 h达高峰,持续至伤后6 h,伤后24 h表达消失.结论脑损伤后上述3种基因表达特点与其它脑损害不同,可能与损伤机制和继发性神经细胞损害有关.     

靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2等基因表达影响的研究

目的 探讨Cyclin D1表达下调对Mdm2等基因表达及人肝癌细胞增殖的影响.方法 用脂质体将Cyclin D1-siRNA转染人肝癌细胞株Hep3B细胞.实验分为空白对照组、阴性对照siRNA组、Cyclin D1-siRNA组.采用RT-PCR和Western blot检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21表达,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡.结果 与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,Cyclin D1-siRNA组P53和P21表达上调(P＜0.05),Cyclin D1、Mdm2和Mdm4表达下调(P＜0.01);3组细胞周期G1、S及G2期均无明显差异(P＞0.05);Cyclin D1-siRNA组较其他两组细胞活力明显减弱(P＜0.01),细胞凋亡明显增强(P＜0.01).结论 Cyclin D1表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达,并能上调P53和P21的表达;Cyclin D1表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡.