人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

人CD28分子突变体的构建和表达

在肿瘤免疫中,发挥主要作用的是Ｔ细胞免疫。Ｔ细胞要完全活化,需要两种信号途径同时活化：第一种信号是经典的ＭＨＣ／多肽－ＴＣＲ／ＣＤ３途径,第二种信号是ＣＤ２８共刺激途径。ＣＤ２８共刺激途径的阻断,将导致Ｔ细胞克隆的耐受和凋亡。因此,ＣＤ２８分子的研究成为免疫学、肿瘤学等领域关注的热点之一。大量研究结果表明,ＣＤ２８分子的活化可促进Ｔ细胞增殖、多种淋巴因子,特别是ＩＬ２的分泌量增高２０～５０倍,并能介导有效的ＣＴＬ杀伤效应〔１〕。目前,国外研究主要集中于ＣＤ２８分子在Ｔ细胞活化、信号转导机制,以…     

CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

探索ＧＰＩ－锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离ＣＤ５９分子。方法通过ＰＣＲ选择性扩增编码成熟ＣＤ５９氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入ＰｉｎＰｏｉｎｔＸａ－３质粒中。ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在丛外微量反应性溶血抑制实验中检测重组ＣＤ５９纯化样品的生物学活性。     

人Fas配体蛋白在大肠杆菌中的融合表达与应用

目的：在大肠杆菌中融合表达人Fas配体蛋白。方法：应用RT-PCR技术，从激活的人外周血淋巴细胞中提取总RNA，扩增Fas配体cDNA，克隆入PCR2.1载体，测序验证后，克隆入带有组氨酸盒的表达载体pQE-31，在大肠杆菌中表达，经亲和层析柱纯化后，用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果：表达的融合蛋白为人Fas配体，其相对分子质量（Mr)为40000。；经透析复性后，具有诱导Jurkat细胞凋亡的作用，用该蛋白分子免疫BALB/c小鼠制备抗血清，以间接ELISA检测了部分自身免疫病与肿瘤患者血清中可溶性的F 苛的含量。结果与进口试剂盒的灵敏性相似。结论：获得FasL单克隆抗体，深入研究FasL的应用提供了材料。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

DNA甲基化在急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T细胞CD28表达缺失中的作用

目的 通过研究急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者外周血CD4+T细胞CD28 mRNA水平和CD28基因启动子调节序列的甲基化状态,旨在探讨DNA甲基化在ACS患者CD4+CD28-T细胞CD28表达缺失中的作用.方法 免疫磁珠分离CD4+T细胞经逆转录后,实时定量PCR(real time-PCR)技术检测CD4+T细胞CD28mRNA的表达水平,亚硫酸氢钠测序检测CD28基因启动子调节序列的甲基化状态.结果 与正常对照组相比,ACS患者CD4+T细胞CD28mRNA表达水平显著减低,差异具有统计学意义[正常对照组比ACS组:(1.066±0.162)比(0.401±0.069),P<0.05].CD28基因启动子区域的甲基化水平显著增高,差异有统计学意义[正常对照组比ACS组:(24.47±3.17)%比(43.33±1.52)%,P<0.05].CD28基因启动子区域DNA甲基化水平与CD28mRNA表达水平呈显著负相关(P=0.01,r=-0.579).结论 ACS患者CD4+T细胞CD28基因启动子区域高甲基化调控了CD28基因转录抑制.DNA甲基化参与了CD4+CD28-T细胞的形成.     

hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定

目的获得高效表达hDll1ext-Fc融合蛋白的细胞系以及具有生物学活性的目的蛋白。方法根据已知序列设计引物,并将hDll1ext基因片段经PCR扩增,酶切后连接至pIRES2-EGFP-Fc中,挑选阳性克隆测序,将正确的重组质粒转染至CHO-S细胞,筛选高表达细胞系,利用rProtein A亲和柱纯化目的蛋白,并通过检测Notch下游信号分子Hes1的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。结果构建了pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc真核表达载体,并筛选了高效表达hDll1ext-Fc的CHO-S细胞系,纯化得到较高纯度的融合蛋白,配合生物活性检测实验显示,可溶性的hDll1ext-Fc能够激活Hes1报告基因,并且能上调Notch下游分子Hes1的表达,证明其能够激活Notch信号通路。结论在CHO-S细胞中成功表达了hDll1ext-Fc融合蛋白,为进一步研究Delta-like-1的生物学功能奠定重要基础。     

人CD20胞外区基因在原核系统中的表达

目的 将ＣＤ２０胞外区在大肠杆菌中表达,并研究表达产物作为抗原筛选抗体的可能性。方法 设计引物从ＰＵＣ１９／ＣＤ２０质粒上钓取取ＣＤ２０胞外区基因,克隆到ＰＥＸＳＥ１载体上,在大肠杆功各融合表达。结果 表达产物的相对分子建立了检测ＣＤ２０ｍＡｂ的ＥＬＩＳＡ方法。结论 为研制ＣＤ２０分子的ｍＲｂ奠定了基础。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

HuCTLA4Ig真核表达载体的构建及其表达

用RT PCR方法从人外周血单个核细胞总RNA中分别扩增出CTLA4的胞膜外区基因和Igγ1恒定区基因 ,将它们拼接后插入质粒pcDNA3。将重组的HuCTLA4Ig/pcDNA质粒转染CHO细胞 ,经筛选得到了高效、稳定表达HuCTLA4Ig的克隆。培养上清经ProteinA亲和层析柱纯化后 ,所得蛋白在非还原条件下SDS PAGE呈分子量为 11kD的一条带 ;FACS检测显示该纯化蛋白与B7分子有良好的结合能力 ;在体外能抑制MLR的增殖反应。     

CD28单抗对CD3AK细胞增殖及表型的影响

CD3AK细胞是用小剂量CD3单抗交联CD3分子而活化的T细胞 ,它具有较强的细胞增殖和细胞毒效能。CD2 8分子则是T细胞激活过程中所需的协同刺激分子 ,可提供T细胞活化所需的第二信号。本文利用CD2 8单抗作为CD2 8分子的配体 ,观察了CD2 8信号途径的激活对CD3AK细胞的影响。结果显示CD2 8单抗可增强CD3AK细胞的增殖活性和趋化团聚形成集落的能力 ,并优先引起CD4+T细胞的增殖。     

老年人T细胞膜型CD28及血清中可溶性CD28的表达及其意义

分析老年人(年龄在60岁以上)外周血T细胞膜型CD28(mCD28)及血清中可溶性CD28(sCD28)的表达水平,探讨该分子在老年人免疫功能改变中的意义。分别收集肝素抗凝及不抗凝的老年人外周血,抗凝血经分离获取单个核细胞,间接免疫荧光及流式细胞仪分析,老年人T细胞mCD28的阳性表达率为男性(41.56%±11.23%)及女性(42.97%±12.02%)。与年轻人[男性(61.51%±17.45%)及女性(62.38%±16.22%)]相比,差别具有显著性(P<0.01)。酶联免疫吸附法(ELISA)检测,老年人血清中sCD28的含量为男性(1.08±0.45)及女性(0.98±0.47)ng/ml,与青年人[男性(0.55±0.16)及女性(0.52±0.13)ng/ml]相比,差别具有显著性(P<0.01)。老年人T细胞mCD28的表达水平下降,而血清中sCD28的含量升高。     

Low T cell reactivity to combined CD3 plus CD28 stimulation is predictive for progression to AIDS: correlation with decreased CD28 expression

In 219 HIV-1-infected men of the Amsterdam cohort we measured CD4⁺ T cell numbers and in vitro T cell responses to CD3 MoAbs with or without CD28 costimulation and phytohaemagglutinin (PHA). The value of these markers was estimated for disease progression within 4 years. CD28 expression on T cells has been related to T cell responses. CD28 costimulation considerably enhanced T cell reactivity (≈8–10-fold) with lower coefficients of variation compared with reactivity to CD3 MoAb alone (median 5 versus 20). T cell reactivity to CD3 plus CD28 MoAb was decreased during HIV-1 infection and was besides CD4⁺ T cell numbers the only independent predictor for progression to AIDS. Compared with the group with high CD4⁺ T cell numbers the relative risk (RR) for the group with intermediate levels was 2.28, with low levels 5.20. In the groups with intermediate and low CD3 plus CD28 responses the RR was 2.04 and 4.16, respectively. The combined RR for both was 4.65 and 21.63. The independence of this marker was confirmed when the group with low CD4⁺ T cell numbers was subdivided into groups with high, intermediate and low T cell responses. The expansion of CD8⁺CD28⁻ T cells was already apparent in HIV⁻ homosexual men, but CD8⁺CD28⁺ T cells specifically decreased in patients with AIDS. CD28 expression on T cells correlated moderately with T cell responses to CD3 plus CD28 MoAb. T cell reactivity to CD3 MoAb in the presence of CD28 MoAb is a stronger prognostic marker than T cell reactivity to CD3 MoAb alone.     

CD28 costimulation and CD28 expression in T lymphocyte subsets in HIV-1 infection with and without progression to AIDS

In a prospective study of 152 HIV-1 patients (with and without progression to AIDS) we examined CD28 MoAb costimulation and CD3 MoAb response using whole blood culture at baseline and up to either the time of AIDS diagnosis or the end of the observation period. CD28 antigen expression on both CD4+ and CD8+ T lymphocytes was also studied in both groups of patients. In patients who progressed to AIDS, CD28 MoAb costimulation was found to be decreased. Univariate time-dependent analysis showed that decreases in (i) absolute numbers of either CD4+, CD4+CD28+, CD8+CD28+ T cells, (ii) CD28 MoAb costimulation, and (iii) CD3 MoAb response, and an increase in CD8+CD28- %, are significant predictors for progression to AIDS. In addition, multivariate time-dependent analysis demonstrated that a decrease in CD28 MoAb costimulation (but not a decrease in CD3 MoAb response) was predictive for progression to AIDS, as were decreases in the percentage of CD4+ T cells and the absolute number of CD4+CD28+ T cells. Thus, CD28 MoAb costimulation can be considered a useful assay for monitoring HIV-1 infection. Furthermore, apart from the early increase in the percentage of CD8+CD28- T cells and an increase in the percentage of CD28- on CD8+ T cells in both groups of patients at baseline compared with normal controls, a negative correlation was found to exist between the percentages of CD4+ or CD4+CD28+ T cells and the percentage of CD8+CD28- T cells; this suggests that these cells are probably mutually regulated.     

含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用

目的：构建含3C蛋白酶酶切位点的人CD226(PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体，并进行表达和初步鉴定。方法：将人CD226分子的胞膜外区基因，克隆入含3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体p-3c—Ig中。测序证实后，转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析件纯化，并通过免疫荧光染色及3C蛋白酶酶切反应进行鉴定结果：经表达和纯化获得CD226胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV304细胞表面的CD226配体有效结合。同时，融合蛋白的Fc段亦经3C蛋白酶切除，从而获得CD226胞膜外区的真核表达分子。结论：成功地获得了含有3C蛋白酶酶切位点的人CD226分子胞膜外区Ig真核表达产物，为进一步对CD226分子进行结构和功能研究，以及X线结晶衍射提供了重要条件。