人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系，从脐血分离单个核细胞，在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞，利用摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac—LDL）和结合欧洲荆豆凝集素（Ulex European Agglutinin 1，UEA—1）进行鉴定，并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明，这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA—1，表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF），有CD31、酪氨酸激酶受体（kinase tyrosine insert domain receptor，KDR）、CD144和内皮一氧化氮合成酶（endothelial NO synthase。ENOS）的基因转录。但是，它们的增殖能力明显不同，分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示，这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论：利用含内皮细胞条件培养液的培养体系，成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。     

阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞功能的影响

本研究旨在观察阿司匹林对人脐血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)功能的影响。采用密度梯度离心法及免疫磁珠分选法从脐血获得CD34+的单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养2周后收集贴壁细胞,通过流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR、DiI-Ac-LDL的摄取及体外血管形成能力等方法对其进行鉴定。用不同浓度阿司匹林(终浓度分别为0.1,1,10,100,1 000,10 000μmol/L)处理EPC 24 h,然后分别采用CCK-8比色法、Transwell小室、黏附能力测定实验来观察EPC的增殖能力、迁移能力和黏附能力的变化。结果表明:低浓度的阿司匹林(0.1-1 000μmol/L)对脐血晚期EPC的增殖无明显影响,但可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林(10 000μmol/L)显著抑制晚期EPC的增殖和迁移,但对其黏附能力无明显影响。结论:低浓度的阿司匹林可增强晚期EPC的黏附及迁移能力,而高浓度的阿司匹林抑制晚期EPC的增殖、黏附及迁移能力,从而抑制内皮细胞的生成。     

脐血血管内皮祖细胞移植对心肌梗死血管形成的影响

背景:人体内存在一种能以血管发生方式形成新生血管的内皮祖细胞,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论.目的:观察犬脐血血管内皮祖细胞移植对梗死心肌血管形成的影响.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2006-05/2007一03在新华医院实验中心完成.材料:接近足月的妊娠杂种犬1只,用于制备脐血血管内皮祖细胞;成年犬36只,随机分为细胞移植组、模型对照组,18只,组.方法:2组犬均于冠状动脉前降支第1对角支分出后结扎建立急性心肌梗死模型.细胞移植组向冠状动脉内注射含5×106个血管内皮祖细胞(经BrdU标记)的生理盐水2 mL,模型对照组同法注射单纯等量生理盐水.移植后1,4,8周处死取材.主要观察指标:心肌标本苏木精-伊红染色确认梗死模型,BrdU免疫组化染色观察心肌血管新生情况,vW因子染色观察梗死心肌血管数.结果:心肌梗死区可见大量的瘢痕组织、成纤维细胞以及小血管形成.细胞移植组梗死心肌区小血管上可见部分细胞核内有棕黄色颗粒,BrdU呈阳性表达;模型对照组无明显新生血管.细胞移植组在心肌缺血区和梗死区血管内皮细胞的胞浆内有棕黄色颗粒,vW因子呈阳性表达;模型对照组不表达vW因子.心肌梗死后第1,4,8周,细胞移植组和模型对照组的心肌缺血区、梗死区的血管数均无明显差异(P>0.05).结论:犬脐血血管内皮祖细胞移植至梗死心肌后可参与血管形成,但尚小能够促进心肌的血管再生.     

脐血内皮祖细胞尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血

背景：内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血临床及动物实验多采用局部肌肉注射。目的：比较脐血内皮祖细胞鼠尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血效果的差异。方法：取Wistar雄性大鼠分成5组：①糖尿病射线照射后结扎双后肢股动脉,尾静脉注射内皮祖细胞（DLV）。②糖尿病结扎双后肢股动脉左后肢局部肌肉注射PBS（DLC）,右后肢局部肌肉注射内皮祖细胞（DLM）。③正常大鼠射线照射后结扎双后肢,尾静脉注射内皮祖细胞（NLV）。④糖尿病不结扎不注射内皮祖细胞（DC）。用绿色荧光示踪内皮祖细胞,苏木精-伊红染色检测肌纤维间毛细血管数,RT-PCR检测双后肢肌肉血管内皮生长因子mRNA水平。结果与结论：DLV组与DLM组比较,右后肢腓肠肌溃疡及缺血好转明显,二者无明显区别;有明显荧光,差别不明显,Ⅷ因子免疫组织化学染色肌纤维间毛细血管数多,相互间无明显差别;腓肠肌血管内皮生长因子表达差异无显著性意义（P〉0.05）。提示脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血尾静脉注射与局部肌肉注射效果相当。     

脐血内皮祖细胞尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血

背景:内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血临床及动物实验多采用局部肌肉注射。目的:比较脐血内皮祖细胞鼠尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血效果的差异。方法:取Wistar雄性大鼠分成5组:①糖尿病射线照射后结扎双后肢股动脉,尾静脉注射内皮祖细胞(DLV)。②糖尿病结扎双后肢股动脉左后肢局部肌肉注射PBS(DLC),右后肢局部肌肉注射内皮祖细胞(DLM)。③正常大鼠射线照射后结扎双后肢,尾静脉注射内皮祖细胞(NLV)。④糖尿病不结扎不注射内皮祖细胞(DC)。用绿色荧光示踪内皮祖细胞,苏木精-伊红染色检测肌纤维间毛细血管数,RT-PCR检测双后肢肌肉血管内皮生长因子mRNA水平。结果与结论:DLV组与DLM组比较,右后肢腓肠肌溃疡及缺血好转明显,二者无明显区别;有明显荧光,差别不明显,Ⅷ因子免疫组织化学染色肌纤维间毛细血管数多,相互间无明显差别;腓肠肌血管内皮生长因子表达差异无显著性意义(P>0.05)。提示脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血尾静脉注射与局部肌肉注射效果相当。     

人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞及其生物相容性

背景：内皮集落形成细胞是内皮祖细胞的一种亚型,体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。目的：探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并观察其生物相容性。方法：采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于Ⅰ型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增,免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后的生物相容性。结果与结论：脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞。     

人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞及其生物相容性

背景:内皮集落形成细胞是内皮祖细胞的一种亚型,体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。目的:探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并观察其生物相容性。方法:采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于Ⅰ型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增,免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后的生物相容性。结果与结论:脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

小鼠内皮祖细胞的培养和移植

背景:内皮祖细胞移植在缺血性心脑血管疾病、创伤愈合等血管类疾病的治疗中展现出广泛的应用前景,目前内皮祖细胞在肺部疾病的研究还比较少.目的:分离和诱导培养骨髓来源的内皮祖细胞,并进行鉴定;经气管移植,观察内皮祖细胞的定位.设计、时间及地点:细胞体外培养和体内移植实验,于2008-05/2009-04在中南大学湘雅二医院中心实验室完成.材料:6周龄C57BL/6J小鼠17只,随机数字表法分为5只供体,10只受体,2只供细胞双荧光染色、免疫细胞化学实验.方法:冲洗小鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,内皮细胞培养液EGM-2MV培养,观察细胞形态,将培养第7天内皮祖细胞与Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白37℃孵育4 h,以检测内皮祖细胞对Dil-乙酰化低密度脂蛋白的摄取,再用20 g/L多聚甲醛固定细胞10 min,固定后用PBS浸洗,将FITC标记的凝集素Ⅰ加入上述标本,37℃孵育1 h,PBS浸洗,通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-凝集素Ⅰ和Dil-乙酰化低密度脂蛋白.主要观察指标:将标记CM-Dil的内皮祖细胞经气管注入小鼠体内,10 d后观察其在体内的定位.免疫组织化学方法检测细胞血管性血友病因子阳性率.移植后内皮祖细胞在体内的定位.结果:贴壁细胞呈现类圆形、纺锤形或多边形,7～14 d可见部分贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观.胞浆摄取Dil-乙酰化低密度脂蛋白,显示红色,胞膜结合FITC-凝集素Ⅰ,显示绿色,双染色阳性细胞为黄色,为正在分化的内皮祖细胞,双阳性细胞达90%以上,血管性血友病因子阳性率90%以上.经气管移植后标记CM-Dil的内皮祖细胞可定位至肺内气管、血管及肾、脾血管.结论:用密度梯度离心法在EGM-2MV培养体系下可以获得较高纯度的内皮祖细胞,该细胞气管移植后可定位至肺内气管、血管及肾、脾血管.     

人外周血内皮前体细胞的分离与体外培养

目的研究体外诱导培养外周血来源内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的可行性并检测其表型和功能。方法用密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞。在加有胎牛血清(fetal blood serum,FBS)、血管内皮生长因子(vascular end othelial growthfactor,VEGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)的M199培养液中培养。用流式细胞仪检测其表面标志CD34和KDR的表达情况。通过荆豆凝集素-1(ulex europaeus agglutinin-1,UEA-1)结合试验和乙酰化低密度脂蛋白(acetylatedlowdensitylipoprotein,acLDL)吞噬试验确定其内皮细胞功能。结果培养过程中可观察到典型的内皮细胞。培养7天后,粘附细胞表达CD34和KDR,阳性率分别为29.5%±9.9%和33.8%±9.2%。粘附细胞的UEA-1结合试验和acLDL吞噬试验均为阳性。结论从成人外周血中可分离到EPCs,并能在体外增殖分化为内皮细胞。体外培养是获得EPCs移植和体外组织工程技术所需要的足够EPCs数量的一条途径。     

人脐血单核细胞诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血单核细胞向神经细胞分化的潜能,为其治疗神经系统疾病提供实验依据。方法采用HES法分离脐血单核细胞（UCBMNCs）,L-DMEM培养液原代和传代培养UCBMNCs,碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经细胞分化,应用流式细胞仪和免疫组化方法分析细胞中nestin、NSE阳性表达情况。结果原代UCBMNCs中有少量细胞表达nestin,阳性率为3.85%±0.88%;经诱导分化后原代（P0）和第10代（P10）细胞形态向神经样细胞转变：NSE阳性表达率分别为25.8%±4.6%、89.3%±8.5%;nestin阳性表达率分别为27.8%±5.8%和86.7%±6.8%。结论UCBMNCs具备神经样细胞分化潜能。     

人脐血间充质干/祖细胞的生长特征

为了评估脐血中间充质干 /祖细胞存在的频率 ,了解脐血间充质干 /祖细胞的增殖特点 ,寻找新的组织工程种子细胞 ,取足月顺产胎儿脐血、淋巴细胞分离液分离单个核细胞 ,悬浮至含 2 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,培养并扩增脐血间充质干 /祖细胞 ,行免疫组织化学鉴定。结果表明 :脐血单个核细胞中间充质干 /祖细胞集落出现的频率为 0 .5× 10 -6,呈成纤维细胞样 ,传 2 0代仍可维持其形态特征 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍。结论 :低血清DMEM培养液能维持脐血间充质干 /祖细胞增殖分化能力 ,脐血间充质干 /祖细胞是又一良好的组织工程与细胞治疗的种子细胞。     

人循环血管内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)的分离、培养、分化及鉴定方法,探索EPCs体外扩增所需的条件。方法采集健康成人外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞(MNC),接种在纤维连接蛋白包被的培养板上,在加有EGM-2-MV-SingleQuots的培养液中培养和扩增。于培养第7天选择免疫荧光(Dil-acLDL/FITC-UEA-1)鉴定培养所得的细胞是否具有EPCs的特征。结果MNC在培养的第2天开始出现成簇现象,第4天细胞由圆形转变为梭形贴壁细胞,呈条索状或管状分布;激光共聚焦显微镜显示双染色阳性的细胞为正在分化的EPCs。结论人外周血MNC在体外经适当条件的培养,完全可以分化成EPCs。     

低体重早产儿内皮祖细胞体外血管生成能力研究

目的：探讨低体重早产儿的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）血管生成能力及调控机制。方法：收集15例低体重早产儿（胎龄小于37周且体重小于 2.5 kg）和19例对照足月儿（胎龄大于37周且体重大于等于2.5 kg）的脐带血,于诱导分化前用流式细胞仪检测EPCs（CD34⁺/CD133⁺/VEGFR2⁺）的数量。分离培养后,检测EPCs克隆形成时间、克隆形成能力、细胞增殖能力和小管形成能力。用蛋白印迹法检测EPCs中血管内皮钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptors 2,VEGFR2）的表达情况。结果：与足月儿相比（0.003%±0.002%）,低体重早产儿脐带血中的EPCs百分比（0.0026%±0.0025%）并无变化,但EPCs克隆形成时间推迟（18 d比12 d）,克隆形成能力、细胞增殖能力及小管形成能力均较足月儿下降（P均<0.05）。蛋白印迹法检测结果显示,低体重早产儿脐带血EPCs中的VE-cadherin和VEGFR2表达降低。结论：低体重早产儿的EPCs血管生成能力受损,可能与EPCs中血管内皮特异性标志物VE-cadherin、VEGFR2表达降低有关。     

血管内皮祖细胞参与人结肠腺癌肺转移灶血管新生的实验研究

目的：初步观察血管内皮祖细胞参与人结肠癌肺转移灶血管生成的情况。方法：体外传代扩增血管内皮祖细胞（EPC）后，采用4’6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）标记。由尾静脉注入接种人结肠腺癌细胞株LS-174-T细胞7周的荷瘤裸鼠体内，分别于接种1周、2周后处死动物，摘取肺脏冰冻切片，荧光显微镜下观察血管内皮祖细胞参与结肠癌肺转移灶血管形成。结果：荧光显微镜下可以观察，接种血管内皮祖细胞1周后的裸鼠肺部血管中有发出蓝色荧光的血管内皮祖细胞，接种2周后肺部转移灶中有蓝色荧光。结论：血管内皮祖细胞可参与人结肠癌肺转移灶血管形成。     

人脐血清代替胎牛血清体外培养脐血树突状细胞

目的　探讨人脐血清取代胎牛血清对脐血来源的树突状细胞体外诱导的影响。方法　无菌采集脐血 ,密度梯度离心法获取界面细胞 ,采用Mini MACS分离技术 ,分离CD34+ 造血干细胞 ,分成 3组 :脐血清组 (加入含 10 %UCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,胎牛血清组 (加入含 10 %FCS的RPMI 16 4 0培养液及细胞因子 ) ,对照组 (含10 %FCS但不含细胞因子 )。细胞因子为IL 4、GM CSF和TNF α ,第 8天收集部分细胞做细胞表型分析、形态学观察。结果　脐血清培养的DC(UCS DC)表面CD80、CD5 4和HLA DR的表达率与胎牛血清培养DC(FCS DC)比较无明显差异 ,UCS DC、FCS DC表达率与对照组比较均明显增高。结论　脐血清代替胎牛血清体外培养脐血来源的DC前体细胞 ,可以诱导出成熟DC ,为临床应用提供了一种新的选择。     

两种分离培养小鼠骨髓来源内皮祖细胞方法的比较

目的 比较密度梯度离心法及全骨髓培养法分离培养内皮祖细胞的差异。方法 取4周雄性近交系C57BL/6J小鼠骨髓,分别使用密度梯度离心法及全骨髓培养法培养,观察细胞贴壁情况和细胞形态,并行DiI acLDL及FITC UEA I双染、vWF、eNOS及细胞表面标志检测。结果 密度梯度离心法培养细胞可形成典型铺路石样改变及形成血管样结构;而全骨髓培养法贴壁细胞形态多样,较多呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形。比较两种方法培养细胞摄取DiI acLDL、结合FITC UEA I双阳性率以及vWF、eNOS及细胞表面标志表达阳性率,差别均有统计学意义（P〈005）。应用密度梯度离心法,随着培养时间延长,表达CD34、CD133及FLk 1细胞逐渐增多（P〈005）。结论 密度梯度离心法及全骨髓培养法在EGM 2MV培养体系下均可培养出内皮祖细胞,但密度梯度离心法较全骨髓培养法培养的内皮祖细胞纯度高。