干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

Nogo-A短发夹样RNA真核表达载体的构建

目的:构建靶向Nogo-A基因的短发夹样RNA(shorthairpinRNA,shRNA)真核表达载体。方法:根据Genebank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列,设计并化学合成2条shRNA,退火后克隆到pGenesil-1质粒的U6启动子下游从而构建重组载体,行限制性内切酶酶切和基因测序进行鉴定。结果:序列分析结果表明,两个重组质粒的shRNA编码序列均成功插入到预定位置。结论:成功构建靶向Nogo-A的shRNA真核表达载体,为进一步研究Nogo-A蛋白的功能及轴突再生抑制的基因治疗提供了新的方法。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA,shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2,进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中,酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段,经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

DF3启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及靶向干扰效果的鉴定

目的：构建带有肿瘤特异性DF3启动子、针对hTERT基因的RNA干扰表达载体pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT,探讨该表达载体的肿瘤靶向性基因抑制作用。方法：分别用针对hTERT基因的RNA干扰寡核苷酸序列及DF3启动子取代质粒pGenesil-10-Micro30中原有的miR30序列及CMV启动子,构建pGenesil-10-miR30-DF3-hTERT载体并进行酶切及测序鉴定。将该载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞及造血干细胞,ELISA法检测hTERT蛋白的表达情况。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实符合设计要求,构建成功。ELISA法检测结果显示,实验组MCF-7细胞及HepG2细胞的hTERT蛋白下降显著（P〈0.05）,其中以MCF-7细胞下降更为明显;造血干细胞实验组则无明显变化（P〉0.05）。结论：DF3启动子调控的hTERT基因的RNA干扰表达载体能有效抑制DF3阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,以乳腺癌细胞效果最为显著,而对端粒酶阳性的正常细胞不产生影响。     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

全血标本保存条件对人总RNA提取效率的影响

目的探讨全血标本保存条件对RNA提取效率和RNA完整性的影响。方法从179例保存在不同温度、不同时间的全血标本中提取总RNA,测定其浓度和纯度、分析其完整性。另选20例标本研究冻融次数对RNA提取效率的影响。179例中的73例总RNA在-80℃下保存1周前、后分别测定浓度和纯度,观察两者差异。结果新鲜血来源的总RNA浓度最高,平均306.51ng/μl;冻融2次全血仍可获得足量的RNA,浓度181.98ng/μl,RNA完整性有所下降;-80℃保存1周的RNA,浓度和纯度都略有下降。结论利用Trizol法可从小体积全血标本中获取足量有效的总RNA;不同保存条件全血中所获取的总RNA浓度存在差异;总RNA-80℃短期保存也会略有降解。     

二甲氨基偶氮苯诱发大白鼠肝癌的研究——癌变过程核糖体和多核糖体RNA含量及其PolyA~+ RNA相对含量的改变

本实验以二甲氨基偶氮苯(DAB)诱发大白鼠肝癌不同时期的肝组织为材料,观察了核糖体和多核糖体RNA含量及其polyA~+RNA相对含量的改变。结果表明:DAB诱癌6周、16周及肝癌的癌区组织核糖体和多核糖体RNA含量均低于正常对照组。而癌周组织的含量未见有显著性变化。核糖体和多核糖体RNA中polyA~+RNA的相对含量在诱癌6周、16周时低于对照组,但在肝癌形成时则高于对照组。本文就这种变化的意义作了初步讨论。     

大鼠肝细胞核体外转录活性随增龄变化的研究

本文用同位素参入法研究不同月龄大鼠的肝细胞核体外转录活性。结果观察到老年大鼠的肝细胞核体外转录活性较断乳鼠及青年鼠分别下降了47％及42％,而肝组织中总RNA的含量随增龄变化不十分明显;负责rRNA及tRNA的RNA聚合酶Ⅰ+Ⅲ所致的转录活性随增龄明显下降,而负责n.RNA合成的RNA聚合酶Ⅱ所致的转录活性则改变不太明显;RNA合成后从细胞核转运到核外的变化趋势是1～10月龄时上升,11—28月龄时下降。     

粪肠球菌总RNA提取方法的比较研究

目的:建立一种简易有效的粪肠球菌总RNA提取方法。方法:用3种不同的方法提取粪肠球菌RNA,用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测提取物的取得率及质量并比较结果。结果:在RNA提取之前加入70%乙醇可有效处理细菌细胞,增加细胞对裂解液的敏感性,再用溶菌酶处理能很好地被消化,获得一种快速、简洁和有效的提取方法。结论:本研究成功的得到一种简易的、改良的粪肠球菌RNA提取方法(方法3)。这是一种适用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的有效提取方法,可用于粪肠球菌和其它革兰阳性菌的分子生物学操作和快速诊断技术。     

HCV-RNA荧光定量标准品制备的研究

目的 介绍一种简便快速的丙型肝炎病毒(HCV)RNA定量标准品的制备方法.方法 RT-PCR扩增目的片段,产物与pGEM-T裁体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品.结果 RNA标准品具有较大的线性范围(109 copies/ml-101copies/ml).批内和批间重复性也较好,cv分别为3.68%和8.40%.结论 本法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用.     

维生素D和维生素K对结石大鼠肾脏骨桥蛋白mRNA表达的影响

目的：进一步明确维生素Ｄ 和维生素Ｋ 与肾结石的关系。方法：健康成年雄性ＳＤ大鼠３６ 只随机分成６组,即对照组、单纯成石组、维生素Ｄ组、诱石剂＋ 维生素Ｄ 组、维生素Ｋ 组和诱石剂＋ 维生素Ｋ组,测定肾脏骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ, ＯＰＮ） ｍＲＮＡ 的表达量和尿晶体成分的浓度。结果：维生素Ｄ 和维生素Ｋ 均可促进肾脏表达ＯＰＮ ｍＲＮＡ;维生素Ｄ可升高尿钙,维生素Ｋ则抑制尿草酸的分泌,诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论：维生素Ｄ过多可促进肾结石形成,而维生素Ｋ 有抑制结石形成的作用。     

用TRIzol试剂抽提新生鼠脑组织总RNA

目的:建立一种快速提取组织RNA的方法.方法:Trizol试剂抽提组织总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳.结果:用此法提取的总RNA通过甲醛变性凝胶电泳获得完整RNA条带.结论:此方法提取的总RNA完整无降解.     

冷血心肌麻痹液温度与SRCa2+-ATPase活性及SRCa2+-ATPasemRNA表达

目的：评价冷血心肌麻痹液（ Ｃ Ｂ Ｃ）温度对心肌保护效果的影响． 方法：离体鼠心经 Ｃ Ｂ Ｃ不同温度（４,８,１２,１６ 和２０℃）停搏１２０ ｍ ｉｎ 及再灌注６０ ｍ ｉｎ, 测定心肌肌浆网（ Ｓ Ｒ） Ｃａ２＋  Ａ Ｔ Ｐａｓｅ 活性、钙摄取和 Ｓ Ｒ Ｃａ２＋  Ａ Ｔ Ｐａｓｅ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达的改变． 结果：４,８,１２℃组 Ｓ Ｒ Ｃａ２＋  Ａ Ｔ Ｐａｓｅ 活性、钙摄取保护优于１６ 和２０℃组（ Ｐ＜ ０．０１）,４℃～１６℃组 Ｓ Ｒ Ｃａ２＋  Ａ Ｔ Ｐａｓｅ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达量为对照组１．１８～１．３２ 倍（ Ｐ＞ ０．０５）,２０℃组表达量为对照组的 １．６３ 倍（ Ｐ＜ ０．０５）． 结论：温度影响 Ｃ Ｂ Ｃ心肌保护效果, Ｓ Ｒ Ｃａ２＋  Ａ Ｔ Ｐａｓｅ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达上调可能与 Ｓ Ｒ泵功能受损的特异修复机制有关．     

表皮生长因子受体2靶向小分子干扰RNA对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的 探讨表皮生长因子受体2(HER-2)靶向小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌细胞顺铀敏感性的影响.方法 采用蛋白质印迹法筛选出特异性的HER-2 siRNA,将其转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞.将实验分为对照组(不转染HER-2 siRNA),非特异性siRNA组(转染非特异性siRNA),HER-2 siRNA组(转染特异性siRNA),3组分别加入0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、10、20 μg/ml不同浓度的顺铂,采用噻哗蓝法检测3组SKOV3细胞增殖情况;在给予1 μg/ml顺铂后,采用膜联蛋白V法检测顺铂组、HER-2 siRNA组与HER-2 siRNA联合顺铂组在不同时间(2～4 d)凋亡率变化的情况;应用蛋白印迹法检测顺铂组及HER-2 siRNA+顺铂组抗凋亡蛋白Bcl-2、存活素、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和促凋亡蛋白第二线粒体衍生蛋白酶活化子(Smac)的表达.结果 暴露于顺钠24 h后,3组细胞增殖率均随顺铂浓度的增加而降低,但降低的幅度不同,其中,转染HER-2siRNA组细胞降低最为显著;在给予1 μg/ml顺铂后,转染HER-2 siRNA组细胞增殖率[(58.1±4.7)%]与转染非特异性siRNA组[(65.3±2.7)%]、空白对照组[(68.5±2.8)%]相比,差异均有统计学意义(P＜0.01),而非特异性组与空白对照组之问差异无统计学意义(P＞0.05);HER-2 siRNA联合顺铂组细胞凋亡率明显增加,与单独使用顺铂及单独使用HER-2 siRNA组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).HER-2 siRNA联合顺铂组抗凋亡蛋白Bcl-2、存活素、XIAP明显低于顺铂组;促凋亡蛋白Smac明显高于顺铂组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HER-2 siRNA能增加卵巢癌SKOV-3细胞对顺铂的敏感性,显著诱导凋亡.HER-2 sIRNA联合顺铂对卵巢癌治疗具有协同作用.HER-2 siRNA和顺铂协同诱导细胞凋亡的机制可能与Bcl-2、存活素、XIAP蛋白质的下调、Smac蛋白质的上调有关.     

CTGF-siRNA对低氧诱导肺成纤维细胞胶原合成的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)的小干扰RNA(siRNA)对低氧诱导的人肺成纤维细胞胶原合成的影响.方法 应用siRNA表达载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,将CTGF-siRNA表达质粒稳定转染人肺成纤维细胞MRC-5, 并将人肺成纤维细胞在低氧条件下(37 ℃, 5%CO2, 1%O2)培养1、2、4、6及12 h.采用定量PCR法测定CTGF及Ⅰ型胶原基因表达,并应用Western blot 法检测CTGF及Ⅰ型胶原蛋白表达变化.结果 低氧培养1 h后,人肺成纤维细胞即可刺激诱导CTGF mRNA表达,其升高水平可持续至6 h.而在CTGF-siRNA表达质粒稳定转染的MRC-5细胞内,低氧诱导的CTGF、Ⅰ型胶原基因及蛋白表达均降低(P<0.05).结论 针对CTGF的siRNA在体外可明显抑制低氧诱导的MRC-5肺成纤维细胞的胶原合成.