逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。     

人CD34抗原基因在HL-60细胞中的转移和表达

本实验构建了编码人CD34抗原基因的逆转录病毒表达载体pLXSN-CD34,经Lipofectin基因转移法将其导入ψ2和PA317病毒包装细胞,通过G418选择培养筛选后获得产生重组病毒的包装细胞株PA317/CD34。采用共培养和病毒上清直接感染两种方式,分别转染HL-60细胞,并应用PCR,APAAP免疫组化染色和间接免疫荧光法检测人CD34抗原基因的转移和表达。结果表明,人CD34抗原基因在HL-60细胞中成功地获得表达,为进一步研究其结构与功能的关系,对早期造血的调控作用,鉴定筛选相应单克隆抗体和干细胞移植提供了有效的途径。     

FLT3配基基因在人骨髓基质细胞中的表达

目的 构建人FLT3配基（FL）逆转录病毒载体，并观察其在人骨髓基质细胞中的表达。方法 用基因重组技术，将FLcDNA插入逆转录病毒载体pLXIN，获得重组载体pLFIN。采用脂质体法将重组质粒pLFIN转染包装细胞PA317，G418筛选抗性克隆，用抗性克隆上清液感染人骨髓基质细胞，RT-PCR和基因组DNA-PCR检测外源基因mRNA的转录及染色体的整合，ELISA法和小鼠CFU-GM集落形成法检测FL蛋白表达量和生物学活性。结果 酶切鉴定表明成功构重组逆转录病毒载体pLFIN；染色体基因组中整合有外源基因FL和Neo；在mRNA和蛋白质水平均可检测到FL表达；24hFL蛋白表达量为4.35ng/ml，活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论 逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞中获得表达，并具有良好的生物学活性，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响提供了实验依据。     

HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5的构建与鉴定

目的构建HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据HPV16型E5基因已知序列,用PCR方法扩增E5片段,利用逆转录病毒载体pLEGFP-N1构建重组质粒pLEGFP-E5。酶切电泳验证重组质粒pLEGFP-E5后,利用脂质体将重组质粒pLEGFP-E5转染入包装细胞PA317。收集PA317病毒上清转染NIH3T3细胞。结果 PCR结果显示扩增片断大小约252bp,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约7300bp。pLEGFP-E5成功转染检测细胞。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5基因构建成功,能有效感染靶细胞。     

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。     

GFP和HSV—TK基因在四种细胞株中的共表达

目的：研究新型报道基因——绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和目的基因HSV-TK基因在哺乳动物细胞内的表达。方法：将同时表达GFP和HSV-TK的多右反子重组逆转录病毒GCGPTKSN，分别转染K562、NS-1、EL4、Sp2/0细胞株，并在体外应用荧光显微镜检测GFP的表达，同时GCV杀伤试验检测HSV-TK基因表达。结果：GFP在四种细胞系中高效表达。高浓度的GCV能有效抑制转染细胞的生长。结论：逆转录病毒载体能介导GFP和HSV-TK基因进入多种细胞系，并在那里共表达。GFP基因是一种很有前途的报道基因，这为基因转移的检测以及转基因细胞的筛选提供了一种新的方法。     

逆转录病毒双顺反子策略有效转导和共表达ALDH1基因与mdr1基因的研究

目的研究含内在核糖体进入位点(IRES) 的逆转录病毒双顺反子载体介导的醛脱氢酶基因(ALDH1)与多药耐药基因(mdr1)转导和共表达.方法以携带ALDH1与mdr1基因的重组逆转录病毒双顺反子G1Na-ALDH1-IRES-mdr1(G1Na-AIM)为载体,电穿孔法转导双嗜型包装细胞PA317,长春新碱筛选;所得病毒生产细胞PA317/ AIM与单嗜型包装细胞GP+E86乒乓感染提高病毒滴度;以重组病毒上清转染K562细胞,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot检测转移基因的整合,流式细胞术(FCM)及MTT分析基因表达,集落培养法测定转导效率.结果双嗜型病毒上清滴度达1.0×105cfu/ml.基因修饰细胞K562/ AIM经PCR 和Southern blot证实双基因稳定整合至基因组,对4-氢过氧化环磷酰胺(4-HC)及长春新碱(VCR)耐药 (提高3～10倍),FCM及集落法检测基因转导效率为62%～70%.结论逆转录病毒IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达,可用于扩大耐药范围,进行体内显性选择.     

逆转录病毒载体介导Neo~R基因转入正常人造血祖细胞

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo~R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo~R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo~R基因的DNA片段,进一步证实了neo~R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。     

Rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定

目的：构建稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株。方法将人Rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term,通过与辅助病毒载体共转染293T细胞,包装为具有感染力的完整重组病毒载体,收集培养上清感染间充质干细胞C3H10 T1/2细胞株,筛选获得G418抗性的基因转染细胞,通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10 T1/2细胞Rspo1分子的表达,并采用细胞计数法观察其上清对SW480结肠癌细胞增殖能力的影响。结果成功构建pEGZ-Term/Rspo1逆转录病毒表达载体,获得了稳定表达人Rspo1的基因转染细胞株C3H10/Rspo1,该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。结论建立了稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株,为进一步利用Rspo1和间充质干细胞靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。     

利用增强型绿色荧光蛋白体外表达探讨逆转录病毒转染软骨细胞的最佳条件

背景:增强型绿色荧光蛋白是目前最佳标记分子,具有荧光特异性高、易于检测等独特的优势,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染同种异体软骨细胞值得研究。目的:构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,探讨转染同种异体软骨细胞的最佳条件。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学。材料:选用30只出生1周的新西兰白兔,雌雄不限,均购自中国科学院实验动物研究中心。双嗜性逆转录病毒包装细胞系PT67购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞购自ATCC公司;DH5a大肠杆菌由本实验室保存;逆转录病毒载体pLNCX2购自Clontech公司;带有增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。方法:实验于2005-08在上海交通大学完成。分离提取并培养新西兰白兔软骨细胞,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染培养后的新西兰白兔软骨细胞,荧光显微镜观察转染的效果。于直径10cm的平皿接种6×105个软骨细胞,分别立即转染及接种12,24,48h后转染逆转录病毒-EGFP,1周后作流式细胞仪测定EGFP表达效率,观察逆转录病毒转染原代软骨细胞最佳时机。软骨酶消化后的软骨细胞接种24h后转染逆转录病毒,分别于第2,3,4,5,6天加250mg/LG418进行筛选。PBS洗涤后作流式细胞仪检测其效率,观察G418筛选的最佳时机。主要观察指标:①EGFP-pLNCX2转染效果。②逆转录病毒转染原代软骨细胞及G418筛选最佳时机。结果:①重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2转染原代兔软骨细胞,经G418初步筛选而获得的高表达格局,可见软骨细胞经过筛选和表达绿色荧光蛋白后,保持正常的形态学,细胞伸出伪足贴壁,基质分泌旺盛。②逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,第7天用流式细胞仪测定转染效率为19.14%,G418筛选的最佳时机为培养后第5天,第7天测定表达效率提升为55.75%。结论:重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2能有效地转染软骨细胞,逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,G418筛选的最佳时机为培养后第5天。     

人红细胞生成素基因在哺乳动物细胞内的稳定表达

通过构建pN_2-EPO逆转录病毒载体,转染PA317包装细胞,收集病毒上清液,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),经G-418筛选及克隆建立了三株能稳定分泌人红细胞生成素(EPO)的细胞系。     

逆转录病毒介导转导的人粒-巨噬系集落刺激因子基因在哺乳动物细胞中的表达(英文)

利用多聚酶链反应(PCR)方法,从活化的人外周血单个核细胞中克隆了人粒-巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA。DNA序列测定证实此片段为完整的GM-CSF cDNA。应用DNA重组技术,将此cDNA重组于逆转录病毒载体pDORneo上,以Lipofectin介导转染病毒包装细胞PA317,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。选取高滴度病毒上清感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选获抗性克隆,PCR方法鉴定重组载体整合于CHO细胞的基因组DNA中。用CFU-GM集落形成实验检测GM-CSF活性,证实转染后的CHO细胞有GM-CSF的稳定、高效表达。     

逆转录病毒介导的GM-CSF在骨髓基质细胞中基因转移与表达

为了探索逆转录病毒介导的GM-CSF在骨髓基质细胞(BMSC)中的基因转移与表达,采用电穿孔法将重组质粒pLXSN/GM和空载体pLXSN转染PA317细胞,经G418筛选,用抗性克隆培养上清液成功地感染了BMSC。经PCR和Southern blot分析证实BMSC基因组中整合有外源NeoR和GM-CSF cDNA,原位杂交显示有较强的GM-CSFmRNA的表达,经增殖法和集落形成法表明转染的BMSC分泌较多的GM-CSF。据此表明,转染的BMSC较未转染BMSC具有更强的支持造血功能,提示BMSC可作为造血功能障碍基因治疗的靶细胞,为GM-CSF基因治疗血液病奠定基础。     

Retroviral preparations derived from PA317 packaging cells contain inhibitors that copurify with viral particles and are devoid of viral vector RNA

Obtaining high expression levels of a therapeutic gene in target cells could be achieved by integrating multiple copies of a recombinant retrovirus. However, we observed that cells retrovirally infected at high multiplicities of infection (MOIs) carried only single or double integrated proviral copies, suggesting that maximum retroviral transduction was achieved at relatively low MOIs. The same results were obtained when purified virus, free of most medium components, was used. Retroviral infection was shown to be inhibited by supernatants of other viral producer cell lines, and this inhibition could be removed by a centrifugation step that also removed more than 90% of infectious virus. Quantitative-competitive PCR of retroviral preparations showed that the amount of retroviral vector RNA present was similar to the amount expected on the basis of virus titers. Our data suggest that retroviral preparations derived from PA317 packaging cells contain inhibitors that copurify with retroviruses and do not contain viral vector RNA. We postulate that these inhibitor particles cannot achieve a productive infection but interfere with transduction of the target cells by infectious virions. This study might define an important criterion for the selection of more effective packaging cell lines.     

Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体的构建及生物活性鉴定

本研究构建Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体,为探讨抑制Fas表达在再生障碍性贫血等疾病治疗中的意义、以及为促进RNA干扰技术的广泛开展奠定基础.用PCR方法获得小鼠U6＋27启动子盒及产生siRNA的相应DNA模板,然后连同增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆入商业化逆转录病毒载体pLXSN,以获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFP-siFas.包装、滴定重组逆转录病毒载体,并感染P815细胞,检测绿色荧光蛋白表达情况及对细胞Fas表达的抑制情况.结果表明：构建的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-siFas能够有效被包装并感染靶细胞,在靶细胞内可同时表达siRNA、绿色荧光蛋白以及新霉素抗性.结论：成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰逆转录病毒载体.     

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.     

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。