SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控

目的探讨SNAP-23对NK细胞杀伤效应的调控作用。方法通过核酸转染仪转染SNAP-23 shRNA（short hairpin RNA）质粒阻断NK92细胞中SNAP-23蛋白的表达，分别利用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和β-己糖氨酶释放实验检测SNAP-23表达下降对NK细胞杀伤效应和胞吐效应的影响。结果核转染仪可将shRNA质粒成功转入NK92细胞，所设计的3条SNAP-23的shRNA能抑制SNAP-23的蛋白表达，继而导致NK92细胞的杀伤活性和胞吐效应下降。结论SNAP-23通过调控NK细胞的胞吐效应而参与NK细胞杀伤效应的调控。     

Syntaxin 4蛋白在NK细胞中的表达及与SNAP-23蛋白的相互作用

目的　研究NK细胞中与囊泡分泌有关的膜蛋白syntaxin 4的表达和与其它蛋白的相互作用 ,为进一步研究NK细胞免疫效应的分泌调节分子机制提供新思路。方法　RT PCR和免疫印迹方法检测人类NK细胞syntaxin 4的表达 ,免疫荧光显微镜观察静息状态和经靶细胞激活后syntaxin4蛋白在NK92细胞中表达和分布的变化 ,免疫共沉淀检测syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白的相互作用。结果　人类NK细胞中在mRNA水平和蛋白质水平均有syntaxin 4组成性表达 ,蛋白产物主要分布在细胞膜上。异种靶细胞刺激后 ,syntaxin 4蛋白有明显的细胞内定位变化和极化现象。syntaxin 4蛋白和SNAP 2 3蛋白有较强的相互作用。结论　syntaxin 4蛋白与NK细胞对靶细胞的识别过程有关 ,并与胞内膜交换相关分子SNAP 2 3蛋白相互作用 ,可作为研究干预移植排斥反应中杀伤性胞吐的新目标分子。     

跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响

目的：观察跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响.方法：用sTNFRI激活NK92细胞的TM-TNF-α反向信号;MTT比色法检测NK92细胞对靶细胞的杀伤作用;β-己糖氨酶释放实验检测NK92细胞在杀伤靶细胞时的胞吐作用;ELISA实验检测NK92细胞sTNF-α的分泌;流式细胞术检测NK92细胞FasL的表达.结果：预先激活TM-TNF-α反向信号,可以促进NK92细胞对靶细胞的杀伤功能;增强NK92细胞的胞吐;促进FasL的表达和sTNF-α的分泌.结论：TM-TNF-α反向信号可能通过促进NK92细胞胞吐、sTNF-α分泌及FasL的表达而促进NK92细胞对靶细胞的杀伤.     

TLR7/8配体(R848)对人NK细胞杀伤功能的作用及其机制的探讨

目的研究R848对人自然杀伤细胞(NK)杀伤功能的作用及其机制。方法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)、纯化NK细胞,加或不加R848进行培养。分别在0、2、6、24、48h收集培养细胞,流式细胞术检测R848对NK细胞表面活化分子CD25和CD69表达的影响;检测R848活化的NK细胞杀伤靶细胞K562的作用、通过检测颗粒酶A、B、穿孔素、TRAIL和NK细胞与靶细胞共孵育后CD107a/b的表达,探讨R848促进NK细胞的杀伤功能机制。结果 R848活化的NK细胞在培养24h时CD69和CD25分子的表达百分率和平均荧光密度达到峰值,随后活化分子的表达有所下降;R848活化的NK细胞对靶细胞的杀伤功能明显增强,TRAIL在不同NK细胞亚群的表达显著增加(P0.05)。当NK细胞与K562共孵育后,R848活化的NK细胞表面CD107a/b的表达较未刺激条件明显增加。结论 R848可直接作用于NK细胞促进其杀伤功能,其作用机制与NK细胞活化后释放颗粒酶和穿孔素增加,并且TRAIL的表达增加有关。     

超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节

目的研究超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节。方法以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/B)活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察CD226分子在NK细胞上的变化;采用51Cr释放实验,观察NK细胞在超抗原作用下杀伤功能的改变;利用激光共聚焦显微镜,观察CD226分子在NK细胞杀伤相的分布。结果在静止PBMC中,CD56 NK细胞的百分率为12.3%,CD56 CD226 细胞仅为1.4%。当效靶比为5∶1时,NK细胞对K562细胞的杀伤率为(3.2±0.2)%。当0.1mg/LSEA或SEB刺激PBMC1d后,CD56 NK细胞的百分率分别为13.5%和14.1%,CD226在NK细胞上的表达水平明显升高,且主要表达在CD56dim细胞上。在刺激第2天,SEA组CD56 CD226 占CD56 细胞69.1%,SEB组CD56 CD226 占CD56 细胞64.3%。刺激第3天,CD226在NK细胞上的表达水平均较第2天明显下降。在超抗原0.1mg/L作用3d中,SEA组和SEB组NK细胞杀伤率均明显高于同期未刺激组NK细胞的杀伤率及新鲜分离NK细胞的杀伤率(P<0.05),在作用的第2天,SEA组和SEB组杀伤率均达到峰值分别为(82.3±6.9)%和(80.6±7.5)%。激光共聚焦结果显示,CD226分子与LFA-1分子共定位于NK细胞与K562细胞的接触部位。结论超抗原SEA和SEB可提高NK细胞杀伤活性,可能与其促进CD226分子在NK细胞上的表达相关,CD226分子可能参与NK细胞免疫突触的形成。     

IL-23与IL-12诱导NK细胞功能的异同及机制初探

目的探讨细胞因子IL-23与IL-12对NK细胞功能的影响及可能的机制。方法密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)或磁珠纯化NK细胞,不刺激或用IL-23或IL-12刺激,用流式细胞术和ELISA法检测NK细胞产生IFN-γ的情况;以K562或Jurkat细胞作为靶细胞,用流式细胞术检测NK细胞的杀伤功能并分析NK细胞在不同的刺激条件下杀伤相关分子的表达情况及pSTAT的表达情况。结果与未刺激组相比,IL-23和IL-12均可以诱导NK细胞呈剂量和时间依赖方式产生IFN-γ;但IL-12而非IL-23可以增强NK细胞对靶细胞K562或Jurkat细胞的杀伤功能。进一步研究表明,IL-12而非IL-23可以诱导杀伤相关分子TRAIL及CD107a/b的表达。此外,IL-12诱导NK细胞表达更高水平的pSTAT4,而IL-23诱导NK细胞表达更高水平的pSTAT3。结论与IL-12相比,IL-23亦可以诱导NK细胞产生细胞因子但不能增强NK细胞的杀伤功能,IL-23不能诱导杀伤相关分子TRAIL及CD107a/b的表达,IL-23可以诱导低水平的pSTAT4但高水平的pSTAT3的表达。     

脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin表达及线粒体自噬形成

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)处理后parkin表达及对线粒体自噬的影响。方法:无菌分离并原代培养小鼠腹腔巨噬细胞;200 ng/ml LPS作用巨噬细胞,JC-1标记线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;RT-PCR检测巨噬细胞parkin mRNA水平;Western blot检测parkin及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平;激光共聚焦显微镜分别检测巨噬细胞在LPS处理前后parkin在细胞内的分布及与LC3和线粒体三者的共定位情况。结果:JC-1染色流式细胞仪检测结果显示,LPS处理后,巨噬细胞线粒体膜电位降低,并随LPS作用时间延长呈持续下降趋势;parkin mRNA在LPS处理6 h内仅有少量的增加,但parkin蛋白水平在LPS刺激6 h后增加明显;parkin在巨噬细胞定位结果表明,未受LPS处理时parkin呈弥散均匀分布,而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集;Western blot检测结果显示巨噬细胞在LPS刺激后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大,表明巨噬细胞发生明显的自噬;激光共聚焦显微镜结果显示,巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、LC3和线粒体三者存在共定位关系。结论:巨噬细胞在LPS刺激后,parkin表达增加并介导线粒体自噬形成,参与对损伤线粒体的清除,可能在巨噬细胞参与的炎症反应中发挥一定的调控作用。     

超抗原对NK细胞亚群凋亡诱导配体表达与功能的调节

目的 研究凋亡诱导配体分子在超抗原活化NK细胞CD56^bright出亚群和CD56^dim亚群上的表达规律和功能。方法以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B（SEA/B）活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察不同活化模型中凋亡诱导配体分子在NK细胞CD56^bright和CD56^dim亚群表达的变化;采用^51Cr释放实验及抗体阻断实验,观察NK细胞亚群的功能与凋亡诱导配体分子表达的关系;利用激光共聚焦显微镜,观察凋亡诱导配体分子在NK细胞杀伤相的分布。结果当超抗原浓度为0．1μg／mL时,TRAIL和TNF在NK细胞上的表达率及NK细胞杀伤活性于培养第2天时达到高峰,FasL在NK细胞上表达未见明显变化。TRAIL和TNF分子聚集于NK细胞与靶细胞的接触部位,FasL分布未见明显变化。结论超抗原SEA和SEB促进TRAIL和TNF在CD56^dim亚群表达,TRAIL和TNF可能参与NK细胞免疫突触的形成。     

调节IL-1受体转位至焦点附着斑的观察

目的 探讨影响I型IL-1受体(IL-1RI)转位至焦点附着斑的相关因素。方法 将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组型和突变型(C末端突变)IL-1RI质粒转染进入成纤维细胞，细胞生长于有或无纤维粘连蛋白的培养皿上，用激光共聚焦显微镜直接观察所表达的融合蛋白在细胞内的定位，IL-1β刺激后发生转位，并观察经免疫细胞化学染色后，细胞骨架蛋白Vinculin的位置。结果 转染了重组型IL-1R1质粒的细胞生长在纤维粘连蛋白上，表达的受体融合蛋白与Vinculin位于细胞膜的焦点附着斑，用IL-1β刺激可致受体转位至细胞内。转染突变型质粒的细胞，表达的融合蛋白位于胞质的核周区域，IL-1β刺激后不产生转位。结论 I型受体转位至焦点附着斑需要Vinculin等细胞外基质的参与并与受体C-末端保守结构域有关。     

NKG2D配体在鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关，NKG2D为NK细胞活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D配体为MHCⅠ类链相关基因产物（MICA、MICB）及ULBPS（人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3），NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本文通过流式细胞仪技术探讨其在鼻咽癌细胞CNE2的表达情况，并进一步分析其在NK细胞杀伤CNE2细胞中的作用。     

Hepatocyte progenitors in man and in rodents--multiple pathways, multiple candidates

In severe injury, liver-cell progenitors may play a role in recovery, proliferating, and subsequently differentiating into mature liver cells. Identifying these progenitors has major therapeutic potential for ex vivo pharmaceutical testing, bioartificial liver support, tissue engineering and gene therapy protocols. Potential liver-cell progenitors have been identified from bone marrow, peripheral blood, cord blood, foetal liver, adult liver and embryonic stem cells. Differences and similarities are found among cells isolated from rodents and humans. This review will discuss identifying markers and differentiation potential in in vitro and in vivo models of these putative progenitors in both humans and rodents.     

On the possible origin of extra-epithelial enterochromaffin cells by budding from the crypts of Lieberkuhn

This study was undertaken to test Pierre Masson's still unconfirmed theory that extra-epithelial enterochromaffin cells in the gut arise in adult life by budding from the crypts of Lieberkuhn under conditions of low grade inflammation. Appendices (900) were reviewed and 19 were selected for serial section study because in random sections they showed lateral fusion of the crypts, one of the key features described by Masson. Ten specimens without crypt fusion served as controls. Sixteen of the 19 study specimens and one of the control specimens showed budding, averaging one bud in every 88 sections. Most buds were in direct contact with Schwann cells in the adjacent lamina propria and 45 per cent of them contained enterochromaffin cells. There was also histologic evidence linking buds and lateral crypt fusion to low grade inflammation. Masson's ideas are, therefore, confirmed insofar as the existence of buds and their relationship to enterochromaffin cells, Schwann cells, and inflammation is concerned. The actual separation of buds from the crypts to form extra-epithelial enterochromaffin cells has yet to be proved.     

大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离及鉴定

目的建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,并探索其分离及鉴定方法。方法雄性Wistar大鼠每天1次连续灌胃给予不同剂量二乙酰氨基芴(2-AAF熏5、10、15、20、25mg/kgBW),第5天行标准的2/3肝切除术,术后按各自剂量继续给予11天,不同时间取肝脏组织,行甲胎蛋白、细胞角蛋白18及19染色并观察。以确定的2-AAF最佳剂量制备大鼠肝干细胞增殖模型,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠肝卵圆细胞,光镜、电镜下观察细胞特点,并进行上述细胞表型标志免疫组化染色。结果2-AAF15mg/kgBW能建立较理想的肝卵圆细胞增殖模型。HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增殖的嗜碱性小细胞,电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点,免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19染色阳性,白蛋白及白细胞共同抗原(LCA)染色阴性。分离所得底层细胞,光镜下表现大小不等、不规则圆形细胞,体积较小,细胞核/浆比例较大,电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,余同增殖细胞特点,免疫组化染色与增殖细胞表现相同细胞表型特点。结论本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞,符合肝卵圆细胞的形态特点、超微结构及细胞表型标志特点。     

人外周血树突状细胞-乳腺癌细胞融合细胞

目的：探讨树突状细胞—肿瘤细胞融合细胞的形态特性，为研制融合细胞疫苗提供形态学依据。方法：将免疫磁珠法分离的人外周血树突状细胞与人乳腺癌细胞株MCF7融合，瑞氏—姬姆萨染色观察；扫描电镜观察树突状细胞、融合细胞的表面超微结构。结果：树突状细胞与MCF细胞按10：1比例融合后，一个乳腺癌细胞可以与一个或多个树突状细胞相融合；扫描电镜下可见分离的树突状细胞表面有突起，树突状细胞/MCF7融合细胞具两种亲代细胞的表面超微结构特点。结论：树突状细胞与人乳腺癌细胞融合后无明显的形态改变。     

人羊膜上皮细胞上清液对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肿瘤作用

目的探讨人羊膜上皮细胞(h AECs)上清液对体外培养的肝癌细胞系BEL-7402细胞迁移、增殖与凋亡的影响。方法 BEL-7402细胞随机分为5组,其中对照组不加h AECs上清液,其余4组加入体积分数分别为6.25%、12.5%、25%和50%的h AECs上清液作用24 h后,通过划痕实验、MTT试验和流式细胞术检测BEL-7402细胞迁移、增殖和凋亡;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达量。结果 h AECs上清液能剂量依赖性地抑制BEL-7402细胞迁移、增殖并诱导凋亡(P0.05);25%和50%h AECs上清液组BEL-7402细胞caspase-3和caspase-8蛋白的切割片断蛋白定量明显高于对照组(P0.05)。结论 h AECs上清液对体外培养的BEL-7402细胞具有一定的抗肿瘤作用。     

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。     

The molecular makeup and function of regulatory and effector synapses

Summary:  Physical interactions between T cells and antigen-presenting cells (APCs) form the basis of any specific immune response. Upon cognate contacts, a multimolecular assembly of receptors and adhesion molecules on both cells is created, termed the immunological synapse (IS). Very diverse structures of ISs have been described, yet the functional importance for T-cell differentiation is largely unclear. Here we discuss the principal structure and function of ISs. We then focus on two characteristic T-cell–APC pairs, namely T cells contacting dendritic cells (DCs) or naive B cells, for which extremely different patterns of the IS have been observed as well as fundamentally different effects on the function of the activated T cells. We provide a model on how differences in signaling and the involvement of adhesion molecules might lead to diverse interaction kinetics and, eventually, diverse T-cell differentiation. We hypothesize that the preferred activation of the adhesion molecule leukocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) and of the negative regulator for T-cell activation, cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4), through contact with naive B cells, lead to prolonged cell–cell contacts and the generation of T cells with regulatory capacity. In contrast, DCs might have evolved mechanisms to avoid LFA-1 overactivation and CTLA-4 triggering, thereby promoting more dynamic contacts that lead to the preferential generation of effector cells.     

Harnessing innate and adaptive immunity for adoptive cell therapy of renal cell carcinoma

The development of immunotherapies for renal cell carcinoma (RCC) has been the subject of research for several decades. In addition to cytokine therapy, the benefit of various adoptive cell therapies has again come into focus in the past several years. Nevertheless, success in fighting this immunogenic tumor is still disappointing. RCC can attract a multitude of different effector cells of both the innate and adaptive immune system, including natural killer (NK) cells, γδ T cells, NK-like T cells, peptide-specific T cells, dendritic cells (DC), and regulatory T cells (Tregs). Based on intensive research on the biology and function of different immune cells, we now understand that individual cell types do not act in isolation but function within a complex network of intercellular interactions. These interactions play a pivotal role in the efficient activation and function of effector cells, which is a prerequisite for successful tumor elimination. This review provides a current overview of the diversity of effector cells having the capacity to recognize RCC. Aspects of the functions and anti-tumor properties that make them attractive candidates for adoptive cell therapies, as well as experience in clinical application are discussed. Improved knowledge of the biology of this immune network may help us to effectively harness various effector cells, placing us in a better position to develop new therapeutic strategies to successfully fight RCC.     

皮肤树突状细胞亚群研究进展

皮肤树突状细胞(DC)作为重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答或自身耐受的发生中扮演着非常重要的角色.皮肤免疫系统中定居着多种DC亚群,主要包括表皮层中的郎格汉斯细胞(LC)与真皮层中的各种真皮DC亚群.健康皮肤中的DC亚群主要有表皮LC、真皮DC(dDC)和浆细胞DC(pDC),dDC又分为Langerin+ dDC及Langerin-dDC等.但在炎症性皮肤,如过敏性皮炎、银屑病等病变皮肤中则存在着炎症性DC亚群.DC由于其复杂的异质性群体,导致了其各亚群的特殊化功能.皮肤DC亚群的特殊化功能,为皮肤性疾病的临床治疗及新型疫苗的研发设计等都提供了良好的新策略.