炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的 快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法 根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物，扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子，从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定，生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物，可以扩增出长2205bp的保护性抗原基因，经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段，对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论 利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建

目的 构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）的两种穿梭载体与上游强启动子。方法 将解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子克隆到载体pblueseript—sk（＋）上，构建载体pBLKSP；以A16R疫苗株（Tox＋，Cap-，弱毒株）DNA为模板，设计合成内外侧引物巢式PCR扩增获得保护性抗原（PA）的全基因，先克隆到载体pBLKSP，再将其和质粒PUB110重组构建成两种穿梭载体。结果 酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论 成功构建了带有强启动子的两种穿梭载体。为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段,并进行克隆、测序分析,制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法利用Oligo6.4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物,纯化PCR扩增产物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定,提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明,所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的 应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段，并进行克隆、测序分析，制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法 利用Olig06．4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMDl8-T载体并进行快速鉴定，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果 获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论 利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

用PCR制备检测丁型肝炎病毒基因芯片的探针

目的：制备诊断丁型肝炎病毒(HDV)cDNA基因芯片探针。方法：针对HDV病毒基因保守区域设计聚合酶链反应(PCR)引物，纯化PCR扩增产物克隆，并测序鉴定。结果：序列分析表明，所扩增的片段均属于HDV特异基因。结论：利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便、实用的方法。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain-like的克隆及生物学特性

目的克隆弓形虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因，分析免疫生物学功能，筛选预防弓形虫感染的疫苗候选分子。方法利用人类、鼠类和其它寄生虫的Calpain基因同源性比较的保守区域合成混合引物，以弓形虫的RNA为模板，应用RT-PCR扩增弓形虫Calpain-like基因片段，扩增的片段通过TA克隆插入克隆载体pET32A，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定和DNA序列分析，用克隆的基因片段制备特异性基因探针，经Northern blot技术证实弓形虫Calpain-like基因mRNA。结果RT-PCR扩增了316bp弓形虫Calpain-like基因，其DNA序列与日本血吸虫Calpain基因同一区域的同源性为70％，与计算机推测的弓形虫Calpain-like基因的同源性为100％。Northern blot显示了弓形虫Calpain-like基因mRNA的大小约6300bp。结论弓形虫RH株基因组中存在Calpain-like基因，Calpain-like基因在弓形虫RH株中高度表达。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。     

金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因克隆

目的 了解金黄色葡萄球菌的生物化学和代谢特征，以及其半乳糖醇酶与产生肠毒素的关系。方法 利用PCR方法从金黄色葡萄球菌标准株中扩增出金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶，克隆到pmD-18T载体上并转化到E．coli．JM109菌株。结果 用特异引物扩增800bp的基因片段，目的基因被克隆，经双酶切和DNA序列测定为金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因。结论 金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因片段可以被特异性扩增和克隆。     

小鼠CD1d1编码区基因的克隆与鉴定

目的:克隆小鼠CD1d1编码区基因。方法:提取小鼠小肠组织总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠CD1d1编码基因,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定。结果:扩增出一条与预期片段大小相符的特异DNA条带,限制性酶切应显示目的基因片段插入T载体,序列测定表明所获取的基因大小为1011bp。结论:成功克隆了小鼠CD1d1编码基因,为进一步重组蛋白及其抗体的制备奠定了基础。     

葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌肠毒素液相悬浮芯片方法的建立

目的 采用Luminex液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测19种葡萄球菌肠毒素和蜡样芽胞杆菌肠毒素的快速筛查方法.方法 根据GenBank公布的葡萄球菌肠毒素entA-entR基因、蜡样芽胞杆菌cesB,nheB基因,设计特异性引物和探针,优化反应体系和条件,建立19种肠毒素的Luminex液相悬浮芯片检测法.结果 Luminex液相悬浮芯片体系检测19种肠毒素互不干扰,经验证80株金葡菌和蜡样芽胞杆菌菌株,均出现特异性荧光中值信号.Luminex液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右.结论 Luminex液相悬浮芯片筛查方法可应用于食物中毒等应急检测的快速和高通量筛查.     

载脂蛋白A1基因克隆及序列分析

目的 :克隆人载脂蛋白A1 (apoA1 )基因。　方法 :选择人胎肝组织 ,提取总RNA ,以此为模板 ,利用RT PCR法获取apoA1成熟肽基因片段 ,琼脂糖电泳分离纯化所得目的基因并克隆至T Vector ;ABI 377自动序列分析仪分析所得基因序列。　结果 :PCR产物经琼脂糖电泳 ,目的基因片段与预期大小相符 ;序列分析仪分析所得基因序列 739bps,与国外报道的完全相同。　 结论 :从人胎肝组织成功克隆apoA1基因     

限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)基因片段,并进行克隆、测序分析。方法设计特异性引物扩增长片段Bt基因,对扩增产物进行RD-PCR扩增,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果运用RD-PCR技术,将长片断的基因(2 000-3 000 bp)分为多个短的片段,片段长度较为均一(200~600 bp)。测序结果表明,所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化,使其适用于基因芯片的探针。     

限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的 运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)基因片段，并进行克隆、测序分析。方法 设计特异性引物扩增长片段Bt基因，对扩增产物进行RD-PCR扩增，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果 运用RD-PCR技术，将长片断的基因(2000—3000bp)分为多个短的片段，片段长度较为均一(200～600bp)。测序结果表明，所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论 运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化，使其适用于基因芯片的探针。     

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因组结构分析

目的：了解５，１０亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）基因组外显子／内含子结构，为进一步的研究ＭＴＨＦＲ基因及寻找突变奠定基础。方法：根据报道的人肝ＭＴＨＦＲｍＲＮＡ序列设计引物，分段扩增基因组ＤＮＡ，进行双向测序，确定基因组序列。结果与结论：ＭＴＨＦＲ基因包括１１个外显子和１０个内含子，外显子的长度分别为９９～２５２ｂｐ，内含子长度分别为１９２～９８１ｂｐ。     

五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立

目的 建立5种生物恐怖细菌的快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法 ,即炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的多重检测.方法 针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性基因序列设计6对引物和相应的特异性探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交,用悬浮芯片扫描仪检测.结果 多重PCR悬浮芯片检测体系能够正确的检测和鉴定5种生物恐怖细菌,特异性好,灵敏度高,可用于恐怖样本的高通量筛查.结论 建立了多重PCR基因悬浮芯片快速检测几种生物恐怖细菌的方法 .     

新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达

目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统. 方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR 技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western 印迹分析与鉴定.结果:应用RT-PCR 技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250 bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE 30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带.结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础.     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

HBV前S区的基因克隆及序列测定

获取ＨＢＶ前Ｓ区基因,并进行序列测定,为今后研究其机理及应用创造条件。方法：用ＰＣＲ方法从含ＨＢＶ基因组的模板中扩增ＰｒｅＳ基因,重组入Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ载体,用自动测序仪,采用荧光素标记的引物,测定基因的序列,结果：成功地扩增到ＰｒｅＳＡＱ ＷＧ ＴＡ ＡＤ