人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

目的研究作为核移植供体细胞的人骨髓基质细胞相关生物学特性。方法应用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质细胞，并对其进行形态观察、免疫荧光分析细胞骨架结构、端粒酶活性测定、核型及细胞周期分析。结果培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架结构：在融合密度达80%-90%时，G0＋G1期细胞所占的比例较高，约占92．58％；检测传至第7代的人骨髓基质细胞具有正常染色体数目（46，XY），端粒酶活性为0．567。结论形态良好、染色体数目正常的人骨髓基质细胞可以作为核移植的供体细胞。     

神经干细胞的端粒酶活性与其增殖分化的关系

目的探讨体外培养的神经干细胞端粒酶活性与细胞增殖、分化的关系,以及细胞分化后端粒酶逆转录酶的表达情况。方法采用无血清培养法从新生大鼠脑皮质分离培养神经干细胞；通过免疫荧光细胞染色鉴定神经干细胞；细胞计数法检测细胞的增殖情况；TRAP-ELISA法测定神经干细胞的端粒酶活性：RT-PCR法和Western-blot法测定细胞分化前后的端粒酶逆转录酶的表达。结果从新生大鼠脑皮质分离培养的神经干细胞具有端粒酶活性；体外培养12周内,神经干细胞的端粒酶活性未见变化,细胞的增殖速率亦未见明显不同；神经干细胞分化后端粒酶活性丧失,端粒酶逆转录酶的mRNA和蛋白质也均未见表达。结论在体外培养过程中,大鼠脑神经干细胞的端粒酶活性和细胞增殖速率未见变化；神经干细胞分化后端粒酶活性丧失,可能是由于端粒酶逆转录酶停止表达所致。     

不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

背景：骨髓基质干细胞取材方便，增殖力强，具有多向分化潜能，且可自体移植，是组织工程中理想的种子细胞。年龄等因素对骨髓基质干细胞生物学特性的影响鲜见报道。 目的：比较不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的差异，为临床细胞移植提供实验依据。 方法：骨髓基质干细胞供体为SD大鼠。按细胞来源分为3组，即幼年组、成年组和老年组。无菌条件下剪断大鼠股骨两端，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，吹打制成单细胞悬液，通过200目的筛网滤过后将其置于培养瓶中培养。取第2代生长均一的细胞，CD44，CD29，CD90 免疫荧光鉴定；观察细胞形态及黏附速度；细胞计数，绘制生长曲线；MTT法检测3组细胞的增殖活力。 结果与结论：CD44，CD29，CD90免疫染色细胞呈阳性；幼年组骨髓基质干细胞的黏附速度快于成年组和老年组；细胞增殖幅度明显 (P < 0.05)；MTT法测定结果显示幼年组骨髓基质干细胞活力强，与另外两组比较差异具有显著性意义(P < 0.05)。提示幼年SD大鼠骨髓基质干细胞增殖快、活力强、可在短时间内大量扩增，是理想的组织工程细胞。     

脑胶质瘤端粒酶活性的表达及端粒长度的分析

目的　研究分析在不同级别脑胶质瘤细胞端粒酶活性的表达及端粒长度的变化。方法　采集 40例脑胶质瘤手术切除标本、 4例正常脑组织 ,通过半定量端粒重复序列扩增 (telomererepeatamplificationprotocol,TRAP) 银染方法检测端粒酶活性水平 ,应用人的端粒序列特异性探针32 P (CCC TAA) 3 进行Southern杂交检测脑胶质瘤细胞的端粒长度。结果　在 40例胶质瘤标本中的 33例(82 5 % )中均检出端粒酶活性 ,而在正常脑组织中无端粒酶活性的表达 ,不同级别胶质瘤之间端粒酶活性水平有明显差异 ;恶性胶质瘤细胞中端粒的长度明显比正常胶质细胞缩短 ,端粒的长度与端粒酶活性的水平有着显著的的负相关。结论　端粒酶活性可以作为脑胶质瘤的恶性标记之一 ,端粒的缩短可能是脑胶质瘤进展的重要因素 ,端粒的修复机制对于维持端粒的稳定性和肿瘤细胞的增殖潜能具有十分重要的意义     

胶质瘤细胞端粒酶活性依赖细胞周期的调控

目的 研究胶质瘤细胞的端粒酶表达是否与细胞周期相关。方法 利用血清饥饿法和特异的细胞周期抑制剂，使细胞同步化于Go、G1、S、G2、M期，采用PCR—ELISA试剂盒对处于不同周期时相的胶质瘤细胞端粒酶活性进行检测。结果 不同周期时相胶质瘤细胞的端粒酶活性不同，去除血清不能影响活性，G0期细胞与非同步化细胞的活性相同；G1期较非同步化细胞的活性为高；S期活性最高；G2期活性比S期明显降低；M期则几乎无活性。结论 端粒酶活性与细胞周期明显相关，胶质瘤形成可能是由于细胞周期的异常调节使端粒酶活性增高，细胞获得不死性所致。     

脑胶质瘤端粒酶活性与亚单位表达的相关性

目的 检测脑胶质瘤组织中端粒酶阳性及其亚单位的表达，研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法 对６例正常脑组织和５１例胶质瘤组织利用端粒重复序列扩增技术（ＴＲＡＰ）检测了端粒酶的活性，利用ＰＴ－ＰＣＲ法对端粒酶不同亚单位的表达情况进行研究。结果 端粒酶活性检测６例正常脑组织均为阴性，５１例胶质瘤组织中１９例阳性。ｈＴＲ亚单位在６例正常脑组织中５例为阳性，在５１例胶质瘤标本中４８例为阳性，ｈＴＲＴ     

脑胶质瘤中端粒酶活性表达及与增殖、凋亡的相关性

目的观察不同级别人脑胶质瘤中端粒酶活性表达及与增殖、凋亡的相关性。方法采集手术中切除的不同级别人脑新鲜胶质瘤标本26例,脑外伤内减压脑组织8例,用TRAP法及TUNEL法、PCNA免疫荧光染色流式细胞仪法检测不同级别脑胶质瘤端粒酶活性以及凋亡、增殖细胞百分率。结果脑胶质瘤中端粒酶活性阳性表达率及代表端粒酶活性的平均△A值,在Ⅰ、Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级之间差别显著(P<0.05),各个级别与对照组之间均差别显著(P<0.05),对照组脑组织端粒酶活性均为阴性。平均PCNA阳性细胞率在正常组,Ⅰ、Ⅱ级和Ⅲ、Ⅳ级之间存在显著性差异(P<0.01)。TUNEL阳性细胞率在正常组与其余各组之间均存存显著差异(P<0.01),Ⅳ级与其余各组之间亦均存在显著差异(P<0.05)。代表端粒酶活性的平均△A值(r=0.78,P<0.05)以及平均PCNA阳性细胞率(r=0.86,P<0.01)分别与胶质瘤恶性级别呈正相关。结论脑胶质瘤中,端粒酶活性阳性及PCNA阳性表达细胞率可作为预测胶质瘤化疗效果和脑胶质瘤恶性程度的标志之一,端粒酶活性表达水平和增殖活性与胶质瘤细胞恶性级别具有相关性。     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变

背景：已知端粒酶活性变化与组织工程应用的安全性密切相关，而目前端粒酶在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中的变化及机制研究尚少。 目的： 观察体外人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化。 设计、时间及地点：细胞学开放性实验，于2006-12/2007-11在吉林大学第三临床医院实验中心及基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。 材料：无菌条件下采集非血液系统疾病的志愿者髂骨骨髓，体外分离培养人骨髓间充质干细胞。 方法：取第3代培养的人骨髓间充质干细胞，应用二甲基亚砜/丁羟茴香醚（DMSO/BHA）联合诱导法诱导其向神经元样细胞分化。 主要观察指标：绘制体外培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。免疫荧光及细胞化学染色法分别检测诱导后细胞的巢蛋白和尼氏体的表达，TRAP-ELISA方法检测人骨髓间充质干细胞诱导前后端粒酶活性的变化。 结果： 体外培养的人骨髓间充质干细胞在第3~8代生长较快,第10代以后细胞的生长能力明显减弱。经DMSO/BHA诱导分化后的细胞能够表达具有神经元特征的巢蛋白及尼氏体结构。此外，TRAP-ELISA结果显示诱导2 h细胞端粒酶活性变化不明显，当诱导6 h以后细胞端粒酶活性明显降低，诱导至24 h时，细胞端粒酶活性已近阴性（P < 0.05）。 结论：人骨髓间充质干细胞在体外成功诱导分化为神经元样细胞的过程中端粒酶活性逐渐降低直至消失。     

端粒酶与脑肿瘤关系的研究进展

端粒酶是一种能延长端粒的逆转录酶，近年研究表明，端粒酶活性与细胞永生化和恶变密切相关。在恶性脑肿瘤中端粒酶呈明显活化状态，很可能是一种全新的恶性脑肿瘤标志物；端粒酶活性的检测对不同类型脑肿瘤的诊断及预后判断具有较高的临床价值，以限制端粒扩增为抗癌新靶点的方法为临床脑肿瘤的治疗提供了新的思路。     

重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3．1his-hTH，与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术，将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3．1his真核表达载体，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3．1his-hTH的正确性；将pcDNA3．1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，24h后观察EGFP瞬时表达情况，10d后进行hTH基因RT-PCR，以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果 (1)酶切和测序结果均证实pcDNA3．1his-hTH的正确性；(2)细胞转染24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，80％以上细胞发出绿色荧光；10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达，免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3．1．his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。     

FACTORS WHICH AFFECT THE FUSION OF ALLOGENEIC MUSCLE PRECURSOR CELLS IN VIVO

Watt D.J. (1981) Neuropathology and Applied Neurobiology 8, 135–147
Factors which affect the fusion of allogeneic muscle precursor cells in vivo
keletal muscle allografts in mice have been used to study the factors which promote the fusion in vivo of muscle precursor cells derived from different strains of mice. Tolerance of host mice to allogeneic donor tissues has been induced either by the injection of donor spleen cells into newborn recipients, or by the irradiation and reconstitution, with donor bone marrow cells, of the haemopoietic system of the thymectomized recipient. The isoenzymes of glucose-6-phosphate isomerase (GPI) have been used as markers to distinguish the contribution of host and donor tissues to these allografts. In 174 of 204 such grafts evidence of both host and donor tissues was found. In 57 grafts which yielded a 'hybrid' isoenzyme of GPI, it was inferred that host and donor muscle cells had fused to form mosaic fibres. The following factors appear to influence the fusion of muscle precursor cells: a the presence within grafts of adequate numbers of precursor cells of both the host and the donor strains; b the particular strain-combinations used; c the immunological state of the host.     

Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells

Multiple studies have reported that adult cells of bone marrow origin can differentiate into muscle, skin, liver, lung, epithelial cells, and neurons. To determine whether such cells might produce neurons and other cells in the human brain, we examined paraffin sections from female patients who had received bone marrow transplants from male donors. Y-chromosomes were labeled using autoradiography and fluorescent in situ hybridization. Neurons and astrocytes were identified histologically and immunohistochemically in neocortex, hippocampus, striatum, and cerebellum. However, most labeled cells in both gray and white matter appeared to be glia. Others have suggested that such Y-labeling represents fusion between host and donor cells, rather than true transdifferentiation. The possibilities of fusion and microchimerism were therefore examined using buccal epithelial cells as a model system. The female patients in this study had received either bone marrow or stem cell (CD34+ enriched) transplants from their brothers. Double labeling for X- and Y-chromosomes showed that Y-labeled buccal cells could not be explained by fusion. Genotyping studies of one patient, her brother, and her son ruled out the possibility of microchimerism. Whether, and under what circumstances, some form of bone marrow transplantation might provide adequate number of cells capable of replacing lost brain cells or enhancing their function will require additional studies.     

不同来源成体神经干细胞促进大鼠脊髓损伤功能修复的比较研究

目的 评价大脑、骨髓和脂肪组织3种不同来源的神经干细胞对大鼠脊髓挫伤的治疗效果.方法 选取来源于同一大鼠成体中大脑、骨髓和脂肪的3个部位的组织,分离、诱导分化为不同来源的神经干细胞;应用自由落体损伤模型装置造成大鼠脊髓挫伤.将不同来源的神经干细胞分别移植入大鼠脊髓损伤部位,通过BBB评分比较修复脊髓损伤功能的效果,应用免疫荧光染色检测不同移植细胞在损伤脊髓中的存活、分布、迁移的情况.另设假手术对照组和生理盐水对照组.结果 与假手术对照组和生理盐水对照组比较,3个细胞处理组BBB评分在2～8周开始增加,9周以后更加明显,差异开始有统计学意义(P<0.05).在移植后1周和4周,细胞移植组中脑源性神经干细胞(SVZ-NSs)组Brdu/nestin+>神经元存活的数目明显高于其他2组.但差异没有统计学意义(P>0.05);到了第8周,3组均仅有少量Brdu/nestin+>细胞存活,相互之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 植入来源于大脑、骨髓和脂肪组织的神经干细胞都可以在一定程度上提高脊髓损伤后运动功能恢复,但SVZ-NSs组的脊髓损伤大鼠运动功能恢复要比脂肪来源的神经干细胞(AD-NSs)组及骨髓来源的神经干细胞(BM-NSs)组更好.AD-NSs由于来源广泛和强有力的增殖能力,相比其他来源的神经干细胞,可能是更好的选择.     

大鼠脑损伤后脑内移植骨髓基质细胞的研究

目的研究大鼠脑损伤后骨髓基质细胞(BMSCs)颅内移植对内源性神经干细胞(NSCs)的作用。方法 48只雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组、移植组、非移植组。大鼠脑损伤后24 h立体定向下局部注射BMSCs,然后每天腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)2次。损伤后14 d和28 d随机处死取脑,行BrdU免疫组化染色以及BrdU和神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化双染色。结果局部注射BMSCs的移植组大鼠表达BrdU/NSE阳性的细胞较非移植组为多。结论大鼠脑损伤后BMSCs对内源性NSCs的分化有促进作用。     

GFP转基因骨髓基质干细胞移植对癫痫鼠脑电的影响

目的　观察绿色荧光蛋白（GFP）转基因骨髓基质干细胞（BMSCs）移植至致痫鼠后的存活、迁移及其对癫痫鼠脑电的影响。方法　分离、培养GFP转基因小鼠BMSCs，移植至青霉素致痫鼠的右侧海马内，比较移植后1w、2w、4wBMSCs在脑内的存活和迁移情况及大鼠脑电改变。结果　BMSCs可以在致痫鼠脑内存活和迁移，随移植时间延长，细胞存活数逐渐减少（P〈0．01）；BMSCs移植可减少癫痫大鼠脑电的痫性放电，降低癫痫波波幅。结论　BMSCs移植于青霉素诱发的癫痫鼠脑内后能够存活、迁移，并能够改善癫痫鼠的脑电生理功能，提示干细胞移植可能成为一种有效的癫痫     

自体骨髓间充质干细胞不同移植途径对脑冷冻伤大鼠神经功能改善的影响

目的探索自体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)不同移植途径对脑冷冻伤大鼠神经功能改善的影响。方法将Wistar大鼠自体骨髓间充质干细胞在体外扩增并经Brdu标记后,通过颈内动脉和脑室系统注射移植入冷冻伤脑水肿动物体内,以免疫组化和神经功能评分评价BMMSCs自体移植的疗效。结果经颈内动脉和脑室系统注射的Brdu标记的大鼠BMMSCs细胞可向脑损伤区域迁移。经颈动脉注射BMMSCs治疗组和经脑室注射BMMSCs治疗组Brdu阳性细胞的数量和神经功能恢复的程度均高于常规治疗组,且有明显统计学差异(P0.05)。两移植组BMMSCsBrdu阳性细胞的数量和神经功能恢复的程度相比无明显差异(P0.05)。结论本实验研究提示,BMMSCs通过循环系统和脑室系统移植后可向脑损伤区迁移而发挥治疗作用,但二者无统计学差异。     

脑肿瘤端粒酶活性的表达及其意义的研究

目的 探讨脑肿瘤中端粒酶的表达情况,及其与恶性肿瘤发生的关系。方法 采用ＴＲＡＰ－角染法检测了３７例及肿瘤组织和４例正常脑组织中的端粒酶活性。结果 ３７例脑肿瘤组织标本中,１６例有端粒酶活性的表达,阳性率为４３．２％,４例正常脑组织中均未检测到端粒酶活性。结论 端粒酶活性的表达与脑肿瘤的恶性程度密切相关,有可能成为恶性脑肿瘤的一个重要的标志物。     

骨髓基质细胞成年大鼠脑内移植

目的 研究骨髓基质细胞脑内移植后的分布和移行，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法 常规培养大鼠骨髓基质细胞，应用免疫组织学方法对细胞进行鉴定，Hoechst33258标记细胞，立体定向移植到大鼠的纹状体，经过一段时间后处死大鼠，脑组织切片，直接在荧光显微镜下检查存活的细胞。结果 细胞移植到大鼠脑内能够长时间存活，移植细胞与宿主细胞有很好的相容性，宿主脑组织的结构无破坏，移植细胞能够移行一段距离，说明脑内存在的信号诱导细胞向一定的方向迁徙。结论 骨髓基质细胞脑内移植后，能够与宿主脑组织整合在一起，无细胞过度增生和胶质瘢痕形成，这种细胞可能成为中枢神经系统自体移植的细胞来源。