凋亡相关基因Bcl-2和Bax在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 研究凋亡相关基因Bcl-2,Bax在早期糖尿病大鼠视网膜的表达，探讨其在糖尿病视网膜病变细胞凋亡中的作用。方法 选择健康成年Wistar大鼠40只，随机分成正常对照（CON），糖尿病1个月（DM1），3个月（DM3）及6个月（DM6）组，腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠糖尿病，制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色，并对染色结果进行计算机图像分析。结果 于CON及DM各组，Bax和Bcl-2二基因的蛋白均在视网膜血管表达，且随病程进展，其阳性反应强度逐渐增加，此外，Bcl-2阳性反应在DM3组于色素上皮细胞出现，在DM6组，再进一步扩大到视杆内节和节细胞，而Bax在DM6亦出现于节细胞。结论 凋亡相关基因Bcl-2和Bax在早期糖尿病大鼠视网膜血管和神经细胞的表达随病程的进展逐渐增强，二者在糖尿病视网膜细胞凋亡中起重要作用。     

早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其特征

目的：研究早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其特征。方法：腹腔内注射链脲佐菌素诱导40只糖尿病大鼠模型,随机分为正常对照组（CON）、糖尿病1月组（DM1）、3月组（DM3）、6月组（DM6）。应用PAS染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）法标记和染射电镜观察进行研究。结果：于糖尿病3月和6月组,见周细胞和内皮细胞鬼影。周细胞和内皮细胞核异染色质聚集靠边,并随病程进展而加重。被TUNEL法标记的细胞核染色质分布不均,表现为环形核、新月形核等。结论：早期糖尿病大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡,内皮细胞亦存在调亡。     

糖尿病早期大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡研究

目的：研究早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡及其特征。方法：腹腔内注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。应用PAS染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）法标记和透镜观察进行研究。结果：在糖尿病3月和6月,可见周细胞和内皮细胞鬼影;周细胞和内皮细胞核异染色质聚集靠边并随病程进展而加重;被TUNEL法标记的细胞核染色质分布不均,表现为环形核、新月形核等。结论：早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡,内皮细胞亦存在凋亡。     

血管内皮生长因子在糖尿病在鼠视网膜中的表达

目的：观察血管内皮生长因子（VEGF）蛋白在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠视网膜中的表达情况，以探讨其在早期糖尿病视网膜病变（DR）中的作用。方法：选择健康成年Wistar大鼠40只，随机分成正常对照组（CON）、糖尿病1个月组（DM1）、糖尿病3个月组（DM3）及糖尿病6个月（DM6）组，每组10只。大鼠腹腔内注射STZ诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色，光镜观察。结果：VEGF于CON和DM1组只表达于内核层及节细胞层部分细胞；病程3个月时，尚可见视网膜血管的阳性反应；6个月时，阳性反应范围又扩大至视杆内节和色素上皮细胞。结论：随病程进展，VEGF在视网膜中的表达呈逐渐增强的趋势，提示它在早期DR的发生、发展中起重要作用。     

血管内皮生长因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达

目的 :观察血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白在链脲佐菌素 (STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜中的表达情况 ,以探讨其在早期糖尿病视网膜病变 (DR)中的作用。方法 :选择健康成年Wistar大鼠 4 0只 ,随机分成正常对照组 (CON)、糖尿病 1个月组 (DM1)、糖尿病 3个月组 (DM3)及糖尿病 6个月 (DM6 )组 ,每组 10只。大鼠腹腔内注射STZ诱发大鼠糖尿病。制备大鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABC法染色 ,光镜观察。结果 :VEGF于CON和DM1组只表达于内核层及节细胞层部分细胞 ;病程 3个月时 ,尚可见视网膜血管的阳性反应 ;6个月时 ,阳性反应范围又扩大至视杆内节和色素上皮细胞。结论 :随病程进展 ,VEGF在视网膜中的表达呈逐渐增强的趋势 ,提示它在早期DR的发生、发展中起重要作用     

细胞凋亡与STZ糖尿病大鼠视网膜微血管病变关系

目的探讨细胞凋亡与STZ糖尿病大鼠视网膜微血管病变之间的关系。方法建立糖尿病大鼠动物模型,随机分为糖尿病3月组(DM3)及6月组(DM6),制备视网膜消化铺片,采用核苷酸末端转移酶介导DUTP缺口翻译法(TUNEL)检测视网膜毛细血管细胞凋亡变化,PAS染色及图像分析,动态观测视网膜微血管形态的改变。同时设立正常对照组。结果3月时糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞发生细胞凋亡,周细胞数目减少,对照组及DM3组周细胞数目分别为(6.71±0.45)个及(6.17±0.45)个,2组比较差异具有显著性(P<0.01);6月时细胞凋亡呈增加趋势,DM6组及对照组周细胞数分别为(5·66±0·60)个及(6.52±0.40)个(P<0.01);与DM3组相比DM6组周细胞数目明显减少(P<0.01)。内皮细胞各组间差异均无显著性(P>0.05)。无细胞毛细血管数目增多。结论糖尿病大鼠视网膜周细胞凋亡呈增加趋势,并与微血管病变有关。     

1～16周糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡、增生特性的观察

目的 观察1～16周糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vessel endothelial cells,RVECs)凋亡、增生特性的变化及p53和bcl-2的表达,探讨糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的发病机制。 方法 用四氧嘧啶造Wistar大鼠糖尿病模型。视网膜血管行碳素墨水灌注,作视网膜铺片和切片、核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TdT mediated dUTP mick end labelling method,TUNEL法）和抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin biotin peraxidase complex, ABC)染色,光镜观察。 结果 1～16周糖尿病大鼠RVECs未见凋亡。与对照组大鼠视网膜相比,血管形态和结构无明显变化。第10～16周糖尿病大鼠RVECs呈增生细胞核抗原、5-溴-2-脱氧核苷尿嘧啶、p53和bcl-2免疫反应阳性,但未见内皮细胞堆积和新生血管形成征象。对照组大鼠RVECs为阴性反应。 结论 1～16周糖尿病大鼠RVECs尚未发生凋亡和增生,但10周时已被激活进入细胞周期。p53和bcl-2的表达可能对稳定早期糖尿病RVECs正常起重要作用。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 157-159)     

促红细胞生成素对糖尿病大鼠视网膜bcl-2、bax和WTp53表达的影响

目的 研究bel-2,bax和WTp53蛋白在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达及促红细胞生成素(EPO)对其表达的影响.方法 48只Wistar大鼠用链脲佐菌素诱导糖尿病(DM),随机分为糖尿病未治疗组和EPO治疗组,分别于1、3、6个月处死大鼠,8只正常Wistar大鼠作为对照组.TUNEL法检测细胞凋亡情况,免疫组织化学法检测大鼠视网膜组织中bcl-2、bax和WTp53蛋白的表达及EPO对其表达的影响.结果 DM3和DM6组大鼠视网膜凋亡细胞较正常组和DM1组大鼠增多;与正常组和DMI组大鼠比较,DM3组和DM6组视网膜bcl-2蛋白阳性细胞数减低,bax及wTp53蛋白表达阳性细胞数较多.EP03、EP06组与DM3组和DM6组比较,bcl-2阳性细胞数增多,bax和WTp53蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 EPO能减少DM大鼠视网膜神经细胞的凋亡,其机制可能与上调bel-2及下调bax以及wTp53蛋白的表达有关.     

色素上皮衍生因子的表达与早期糖尿病大鼠视网膜血管形态学的改变

目的探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)mRNA在不同病程糖尿病大鼠模型视网膜中的表达水平及其与早期糖尿病大鼠视网膜血管病变之间的关系。方法 48只健康Wistar大鼠随机分成糖尿病1个月组(DM1)、3个月组(DM3)和6个月组(DM6)与正常对照1个月组(CON1)、3个月组(CON3)、6个月组(CON6),每组各8只。链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠动物模型,分别于造模后1个月、3个月、6个月行视网膜血管铺片和PEDFmRNA的原位杂交,观察大鼠视网膜微血管的改变和PEDFmRNA表达情况。结果 (1)DM3和DM6组可见毛细血管迂曲,走形不规则,管腔粗细不均,以DM6组病变最重,可见无细胞毛细血管。(2)周细胞数量:DM1组与CON1组相比差异无统计学意义(CON1组6.45±0.64,DM1组6.52±0.75,P>0.05),DM3及DM6组均较CON3组、CON6组明显减少(CON3组6.51±0.70、DM3组6.06±0.65,CON6组6.47±0.60、DM6组5.45±0.80),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。(3)CON1和DM1组PEDFmRNA在节细胞层、内核层及RPE层均有阳性细胞表达,CON1组64±10、DM1组53±8,差异无统计学意义(P>0.05);CON3组和DM3组PDEFmRNA在节细胞层、内核层、RPE层阳性反应细胞表达减少,CON3组68±11、DM3组49±12,差异有统计学意义(P<0.05);CON6组和DM6组PEDFmRNA仅在内核层和节细胞层表达,RPE层只见极少阳性细胞,CON6组58±8、DM6组34±14,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论糖尿病视网膜病变的发生、发展与周细胞数量减少、PEDFmRNA表达降低密切相关,两者的表达同糖尿病视网膜病变的发生、发展存在时效和空间关系。     

糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞p53、bcl-2及生长因子的表达与细胞周期阻滞

目的 观察p53、bcl-2、bax基因、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibro blast gro wth factor, bFGF）、胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor-I, IGF-I ）及其受体在1～20周糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VECs) 的表达以及与细胞周期阻滞的关系。 方法 四氧嘧啶(alloxan)诱导制作糖尿病大鼠模型；免疫组织化学染色，光、电镜观察；斑点印迹（dot blotting）测定p53、bcl-2 mRNA；Western 印迹（Western blotting）测定p53、bcl-2蛋白。 结果 免疫组织化 学染色后光学显微镜观察显示8～20周糖尿病大鼠视网膜节细胞层、内核层的各类血管都呈p53、bcl-2免疫阳性反应。电镜观察显示阳性反应物沉淀在VECs。VECs同时为VEGF、bFGF、IGF-I蛋白及其受体阳性反应。视网膜内其它细胞及同窝对照大鼠和1～6周病程糖尿病大鼠视网膜所有细胞均未见上述蛋白阳性反应。Dot blotting测定结果显示，20周糖尿病大鼠视网膜组织有p53和bcl-2 mRNA表达。Western blotting测定证实20周糖尿病大鼠视网膜表达p53和bcl-2 蛋白。对照组及1 ~ 20周糖尿病大鼠视网膜内未见bax阳性反应物。 结论 p53、bcl-2可能参与介导糖尿病大鼠视网膜VECs周期阻滞。高糖刺激生长因子VEGF、bFGF、IGF-I及其受体的表达，生长因子可能通过自分泌途径维持VECs存活。 （中华眼底病杂志，2003，19：29-33）     

糖尿病大鼠视网膜PEDF表达与神经退行性改变

目的观察色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)在糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜中的表达以及视网膜神经细胞损伤情况,探讨早期糖尿病视网膜病变发病机制。方法 72只SD大鼠随机分为正常对照组、DM0.5个月组、DM1个月组、DM3个月组及DM5个月组。DM组大鼠利用链脲佐菌素建立DM模型。RT-PCR及Westernblot检测各组大鼠视网膜PEDFmRNA及蛋白的表达,TUNEL法行原位细胞凋亡检查,透射电镜观察视网膜超微结构改变。结果 PEDFmRNA及蛋白在正常大鼠视网膜的表达量分别为0.410±0.016、0.420±0.030;DM0.5个月组表达未见明显改变,分别为0.399±0.032、0.399±0.032,与正常对照组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05);DM1个月组PEDFmRNA及蛋白表达开始减少,分别为0.344±0.044、0.375±0.028,与正常对照组比较,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01);DM5个月组PEDFmRNA及蛋白表达量约为正常对照组的1/2,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。TUNEL染色显示凋亡阳性细胞主要位于视网膜神经节细胞层,随病程延长逐渐增多。透射电镜显示DM0.5个月组仅视网膜神经纤维层发生轻微超微结构损伤,随病程延长,视网膜全层发生神经退行性病变。结论在发生临床可见的微血管病变前,DM大鼠已发生视网膜神经退行性改变,PEDF在视网膜的表达逐渐减少,提示其可能在早期糖尿病视网膜病变的发生、发展中发挥重要作用。     

Diabetes has an additive effect on neural apoptosis in rat retina with chronically elevated intraocular pressure

PURPOSE: Diabetes mellitus (DM) is a risk factor for open-angle glaucoma, although the mechanistic interrelationship of the two is debatable. The purpose of this study is to test whether DM augments neural apoptosis in rat retina with chronically elevated intraocular pressure (IOP). METHODS: Sprague-Dawley rats were made diabetic by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). At one month after STZ injection, three episcleral veins in one eye were cauterized to elevate IOP. Rats without STZ injection were treated likewise as diabetic controls. At 2 weeks, 1 month, and 2 months after cauterization, the retina was dissected, flat-mounted, and subjected to terminal dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. TUNEL positive cells per unit area of the whole retina were measured. RESULTS: DM did not affect base line IOP or augment IOP elevation due to episcleral vein cauterization. TUNEL positive cells, which primarily consisted of the neurons and glial cells in the inner retina including retinal ganglion cell (RGC), were counted consistently eight times more in the diabetic retina without IOP elevation than diabetic controls (n = 9, p < 0.001). The cauterization significantly elevated IOP up to 28.9 mmHg (p < 0.001), which was reduced over time, and substantially induced apoptosis in a IOP-dependent fashion (p < 0.001). Ocular hypertensive retinas with DM had significantly more TUNEL positive cells than those without DM despite of the similar time course of IOP changes (p < 0.001). CONCLUSIONS: DM has an additive effect on apoptosis induction by chronic elevation of IOP. Diabetes may act as a risk factor of open-angle glaucoma by increasing susceptibility of retinal cells including retinal ganglion cells to apoptosis triggered by additional stresses such as elevated IOP.     

洛美利嗪对糖尿病早期大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的： 探讨洛美利嗪(lomerizine,LOM)对糖尿病早期大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的保护作用及其机制。

方法： SD大鼠随机分为对照组(CON)、糖尿病组(DM)及洛美利嗪组(LOM),每组40只大鼠。DM和LOM组链脲佐菌素(STZ)按60mg/kg一次性腹腔注射诱导糖尿病模型,CON组给予等量无菌柠檬酸钠溶液腹腔注射。LOM组于糖尿病鼠模型成模后,每日予LOM 60mg/kg灌胃,CON组和DM组采用等量生理盐水灌胃。于第4,8,12wk分别行HE、透射电镜、TUNEL检测RGCs的凋亡情况,同时采用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。

结果：(1)形态学观察：随病程延长,逐渐出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变。透射电镜下可见DM组RGCs出现不同阶段的凋亡征象,且随病程延长逐渐加重。LOM组与同期DM组对比,在第8,12wk时RGCs凋亡征象减弱。(2)TUNEL检测：CON组大鼠视网膜神经节细胞层未见凋亡细胞。DM组4wk时视网膜神经节细胞层偶见TUNEL 阳性细胞,并随病程延长逐渐增多,凋亡指数与同期CON组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。LOM 组8,12wk时,与同期DM组比较,染色阳性的RGCs明显减少,凋亡指数明显下降,差异显著(P<0.01)。(3)激光共聚焦显微镜钙离子浓度检测：DM组与同期CON组比较：DM组8,12wk 的RGCs内钙离子荧光染色强度明显升高,有显著差异(P<0.01)。LOM组与同期DM组比较：LOM 组8,12wk的RGCs内钙离子荧光染色强度明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。

结论：LOM对糖尿病大鼠早期RGCs的凋亡具有保护作用。     

糖尿病大鼠早期视网膜神经节细胞凋亡机制的探讨

目的：探讨糖尿病大鼠模型早期视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的机制。

方法：SD大鼠60只,随机分为对照组(CON)及糖尿病组(DM),糖尿病组一次性腹腔注射1% STZ诱发糖尿病鼠模型,两组于第4,8,12wk分别行HE、透射电镜及TUNEL法检测RGCs的凋亡情况,并应用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子浓度的变化。

结果：糖尿病组第8wk开始出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变,第12wk更为明显。糖尿病组透射电镜下可见第4wk时RGCs出现线粒体肿胀; 第8wk时RGCs内肿胀的线粒体更为明显、数目增多,染色质边集于核膜周边,部分细胞体积缩小、细胞器减少; 第12wk时出现RGCs体积变小,甚至出现细胞核断裂。TUNEL阳性RGCs最早于糖尿病组第4wk时出现,随病程延长凋亡的阳性细胞逐渐增多,凋亡指数与同期对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病组第8,12wk时RGCs内钙离子浓度明显高于同期对照组,差异显著(P<0.01); 糖尿病组第8wk与第12wk比较,升高差异亦有统计学意义(P<0.05)。

结论：糖尿病早期出现了视网膜神经节细胞的凋亡,其机制可能与细胞内钙离子浓度升高有关。     

玻璃体内注射色素上皮源性因子对大鼠早期糖尿病视网膜病变的保护作用

目的　观察玻璃体内注射色素上皮源性因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ-ｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ,ＰＥＤＦ）对ＳＤ糖尿病大鼠视网膜ＰＥＤＦ、血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）、炎性相关因子细胞间黏附分子-１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ-ｃｕｌｅ-１,ＩＣＡＭ-１）和单核细胞趋化蛋白-１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＭＣＰ-１）以及细胞通透性相关因子紧密连接蛋白-１（ｚｏｎｕ-ｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ-１,ＺＯ-１）和蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ,ＰＫＢ,又称Ａｋｔ）表达的影响,探讨ＰＥＤＦ对早期糖尿病视网膜病变的保护作用。方法　选取６～８周龄ＳＤ大鼠６０只,随机分为４组:正常对照组（ＣＯＮ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病生理盐水注射组（ＤＭ＋ＮＳ组）和糖尿病ＰＥＤＦ注射组（ＤＭ＋ＰＥＤＦ组）。链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型后第１周、２周、３周时,ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠玻璃体内注射ＰＥＤＦ,而ＤＭ＋ＮＳ组注射同样体积的生理盐水。第４周时处死大鼠,摘出眼球,进行视网膜组织病理学及电镜观察。并采用免疫组织化学方法检测视网膜ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１以及ＺＯ-１、Ａｋｔ的表达情况。结果　糖尿病大鼠均造模成功。４周糖尿病病程尚不能导致明显的视网膜新生血管形成。在透射电镜下,ＤＭ组大鼠视网膜可见神经节细胞水肿,线粒体肿胀变大,基质肿胀明显,可见大部分或全部的嵴消失,部分双侧膜融合,粗面内质网扩张,而玻璃体内ＰＥＤＦ注射可以明显地改善这一病理改变。ＤＭ组大鼠ＰＥＤＦ主要表达于视网膜神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层、光感受器基质以及色素上皮层、脉络膜等部位;ＶＥＧＦ主要表达于神经节细胞层,ＩＣＡＭ-１主要表达在光感受器层,ＭＣＰ-１主要表达在视网膜内层细胞,包括节细胞层和内核层,ＺＯ-１蛋白主要表达于内核层的细胞以及神经节细胞,Ａｋｔ主要表达于内丛状层以及脉络膜的细胞浆中。同ＣＯＮ组相比,ＤＭ组、ＤＭ＋ＮＳ组视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,而ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达增加,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达减少,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ的表达较ＤＭ组和ＤＭ＋ＮＳ组差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,但ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达减少,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达增多,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＰＥＤＦ可以明显地改善糖尿病视网膜病变早期视网膜神经节细胞的损害,通过减少炎性因子和增加细胞连接蛋白而减轻血-视网膜屏障的破坏,从而对早期糖尿病视网膜病变起一定的防治作用。