再生丝素膜对Ad—VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3．0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）。目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF（Ad—VEGF165）转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11／2008—04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法：将Ad—VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降（P〈0．05）。再生丝素膜组Ad—VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高（P〈0．05），而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。     

Ad-Ang-1转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

目的研究经腺病毒介导的人血管生成素-1（Ad-Ang-1）转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成活性及其分子机制。方法将Ad-Ang-1腺病毒病毒子感染再生丝素膜上培养的wI-38人胚肺成纤维细胞,通过ELISA法检测再生丝素膜对成纤维细胞目的基因表达的影响,将Ad—Ang-1转基因WI-38细胞修饰的丝素材料进行鸡胚尿囊膜血管形成实验（CAM）和兔角膜层间植入诱导角膜新生血管试验,并用ELISA法检测其对血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、血小板衍化生长因子（PDGF）表达的影响。结果Ad—Ang-1可感染再生丝素膜上培养的成纤维细胞,ELISA法检测结果表明sF组Ad．Ang．1转基因W1．38细胞可以成功表达目的基因（P〈0．05）。CAM实验表明Ad-Ang-l转基因wI-38细胞修饰的再生丝素膜具有促进CAM血管生成的活性,并通过兔角膜层间植入实验进一步证明Ad-Ang-1转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导角膜组织血管生成的作用．其机制可能与再生丝素膜对Ad-Ang-l转基因的WI-38成纤维细胞中不仅可以成功表达目的Ang-1,而且还可使与血管生成和组织损伤修复相关的VEGF、FGF2、PDGF基因表达水平明显提高有关。结论Ad-Ang-I转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导血管生成的作用,为今后进一步采用转基因技术对生物材料进行修饰或改性、研制出具诱导性的医用生物膜材料创造了条件。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用,采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取P2代骨髓间充质干细胞,分为3组,正常培养组为对照组,其他2组分别转染重组腺病毒（Ad.bFGF-eGFP）及空病毒（Ad.eGFP）。相差显微镜观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞增殖曲线,ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型;碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组;ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化,增加增殖活力,促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质千细胞后bFGF目的基因的表达情况，并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法：实验于2005—03／2006—02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，构建含bFGF基因的腺病毒表达载体，利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后，将细胞接种12孔培养板，培养至90％融合时弃上清，调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果，以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后，胰酶消化，置于6孔板内，每孔细胞数量5&;#215;10^5，2d后细胞贴壁生长于盖玻片上，分别转染Ad．bFGF、Ad．GFP，同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Westem—Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达，ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果：①pcDNA3／bFGF的鉴定结果：成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad．GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定：转染48h后，绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时，腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关（P〈0．05），当〉200时转染效率趋于稳定，均在96％以上。③Ad．bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况：bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad．bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒，阳性表达率为86％，而转染Ad．GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western—Blot示转染Ad．bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad．GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad．bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng／L，此后逐渐下降，但至转染第28天时仍显著高于空白对照（441ng／L，128ng／L，t=4．31，P〈0．01）。④转染Ad．bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响：骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论：采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定

目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广.实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室).①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠.②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷犁重组腺病毒.⑧实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因.并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度.结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TIC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒.②重组腺病毒Ad.VEGFl65的鉴定:聚合酶链反应的产物进行Nco I酶切鉴定,可得到597 bp、146 bp 2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfa/L.结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全.     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。     

人血管生成素-1和血管内皮生长因子VEGF_(165)腺病毒载体构建

目的:克隆人血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor165,VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1)的全长编码基因,构建表达该基因的复制缺陷型腺病毒载体Ad-Ang1和Ad-VEGF165。方法:通过RT-PCR方法克隆人VEGF165和Ang1全长编码基因。Ad-VEGF165和Ad-Ang1通过同源重组方法构建。将Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染大鼠胚胎心脏成肌细胞(H9C2)24h后,Westernblot方法分析VEGF165和Ang1蛋白表达量;核酸电泳分析细胞基因组降解检测凋亡水平。结果:测序显示VEGF165序列与基因库序列相同;Ang1序列与基因库序列存在一个碱基的差异,但编码氨基酸无改变。VEGF165和Ang1蛋白表达分别为对照组的11.65倍和3.53倍。Ad-VEGF165和/或Ad-Ang1转染后的H9C2细胞对过氧化氢诱导的细胞凋亡具有明显的抵抗能力。结论:所构建的Ad-Ang1和Ad-VEGF165能有效转染心脏成肌细胞,表达出功能性目的蛋白,具有抗细胞凋亡作用。     

再生丝素纤维的力学性能及其生物可降解特征

背景:再生丝素纤维溶解过程中丝素蛋白的分子量不可避免地会产生一定的降解,致使再生丝素纤维至今未进入实用阶段。目的:获得生物可降解的再生丝素纤维。设计:单一样本实验。单位:苏州大学材料工程学院丝绸工程江苏省重点实验室。材料:下脚蚕丝由苏州丝绸进出口公司提供。方法:2003-01/2004-12在苏州大学材料工程学院丝绸工程江苏省重点实验室完成。通过控制废弃天然丝素纤维在中性盐溶解时分子量的变化、湿法纺丝工艺条件和牵伸倍率方法纺制具有一定力学性能和生物可降解的再生丝素纤维。具体步骤:①制备丝素。②制备纺丝液。③再生丝素纤维湿法纺丝。④采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳法测定溴化锂溶解后丝素溶液的分子量。⑤测定丝素纤维的结晶度和取向度。⑥测定再生丝素纤维的力学性能。⑦测定丝素纤维的体外酶降解率。主要观察指标:①经溴化锂溶解的丝素蛋白的相对分子质量。②X射线衍射结果。③再生丝素纤维的体外酶降解率。结果:①经溴化锂溶解后,丝素蛋白纺丝液的分子量主要分布在10万以下。②在再生丝素纤维湿法纺丝的凝固、牵伸过程中,丝素的构象从无规卷曲转变为分子链中β-折叠和无规卷曲/α-螺旋构象共存。③用放线菌酶对六氟异丙醇法纺制的再生丝素纤维的体外酶降解实验表明,再生丝素纤维其30d的降解率为37.16%,天然丝素纤维的30d的降解率为10.70%。结论:通过控制再生丝素纺丝液分子量、湿法纺丝工艺条件和牵伸倍率方法,可纺制具有一定力学性能和生物可降解的再生丝素纤维。     

VEGF165 and angiopoietin-1 decreased myocardium infarct size through phosphatidylinositol-3 kinase and Bcl-2 pathways

Angiogenic growth factors, vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-1 (Ang1) could decrease myocardial infarct size, which was assumed to be related with newly formed capillaries. We doubted that these capillaries could do this solely and the potential protective mechanisms of VEGF and Ang1 on myocardium need to be evaluated. Three types of adenoviruses encoding human VEGF(165) (Ad-VEGF(165)), human angiopoietin-1 (Ad-Ang1) and green fluorescent protein (Ad-GFP, as a parallel control) were constructed. Experiments were taken both in vitro and in vivo. As in vitro, the antiapoptosis effect of VEGF(165), Ang1 and VEGF(165)+Ang1 on cardiac myoblasts was observed, which seemed to be related with the activation of phosphatidylinositol-3 kinase and Bcl-2 pathways. As in vivo, adenoviruses were intramyocardially injected immediately after the ligation of the left anterior descending coronay arteries in rats. The results showed positive effect of VEGF(165), Ang1 and VEGF(165)+Ang1 on decreasing the myocardial infarct size at the 7th day. Myocardial PI-3K activity and Bcl-2 expression were elevated relatively at the 3rd day. The protective effect of VEGF(165) and Ang1 on the myocardium may broaden their functional research and contribute to their clinical use in the future.     

再生多孔丝素膜创面局部运用激活不同部位T细胞的作用

背景:丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白,其具有良好的理化特性及生物相容性。而目前国内外有关再生多孔丝素膜植入体内后对T淋巴细胞的激活作用研究未见报道。目的:观察再生多孔丝素膜植入大鼠局部创面后对外周血单个核细胞、脾脏及胸腺中T淋巴细胞的激活作用。方法:切除SD大鼠背部皮肤建立2cm×2cm创面,随机分为2组:实验组覆盖经预处理的再生多孔丝素膜,将已切除皮肤的表皮盖在丝素膜上进行缝合,对照组仅覆盖自身表皮层。于术后第3,14,28,56,90天观察创面愈合及丝素膜的残留情况,采用双色免疫荧光及流式细胞术分析大鼠外周血、脾脏及胸腺中CD3+CD25+/CD3+T细胞百分率。结果与结论:植入早期,两组均可见局部、轻微的炎症细胞浸润,主要为淋巴细胞;至28d后,炎症细胞逐渐减少,并且在整个动态观察过程中,两组结果一致。实验组外周血中活化T细胞在14d之前呈一过性升高,随后开始下降,至28d以后,活化T细胞水平趋于稳定,与对照组无明显差异(P>0.05);脾脏与胸腺T细胞均有少量活化,随后即开始下降并趋于稳定,胸腺中CD3+CD25+/CD3+T细胞的阳性率较脾脏微高,与对照组均无明显差异(P>0.05)。说明再生多孔丝素膜对T淋巴细胞的激发作用较小,引发机体细胞免疫应答的能力较弱。     

丝素蛋白对磷酸钙骨水泥抗压强度及注射性的影响术

背景:高分子材料对磷酸钙骨水泥力学性能的增强作用已得到了一定的证实,但往往会同时减弱复合材料的注射性能,影响复合材料的临床应用.目的:将丝素蛋白加入磷酸钙骨水泥固相粉末中,观察其对骨水泥抗压强度和注射性的影响.设计、时间及地点:对照实验,于2007-09/12在苏州大学分析测试中心实验室完成.材料:磷酸钙骨水泥购自上海瑞邦生物材料有限公司,丝素蛋白为苏州大学材料工程学院自行合成.方法:按5,10,15,20,25,30 g/L的丝素蛋白质量比例,用自制的粉末搅拌器将丝素蛋白粉末和骨水泥固相粉末混合均匀,依次设为6个实验组,以单纯磷酸钙骨水泥为对照组,液固比均为0.4 mL/g.主要观察指标:测定丝素蛋白/磷酸钙骨水泥复合材料的抗压强度、注射系数,应用扫描电镜观察试件断裂面的微脱结构特征.结果:随着丝素蛋白质量比例增加,磷酸钙骨水泥的抗压强度呈现先上升后下降的趋势,当丝素蛋白质量比例为1%-2.5%时,抗压强度显著高于对照组(P<0.05).注射系数随着丝素蛋白质量比例增加而逐渐下降,当丝素蛋白质量比例为1.5%-3%时,注射系数显著低于对照组(P<0.05).扫描电镜发现,丝素蛋白呈网状,贯穿于磷酸钙水泥晶体间,并将磷酸钙水泥晶体紧密连接.结论:丝素蛋白能在不明显影响注射操作的情况下,显著提高丝素蛋白/磷酸钙骨水泥复合材料的抗压强度.     

改性丝素蛋白支架与生长因子基因修饰脂肪间充质干细胞构建组织工程脂肪

背景：构建工程化的脂肪组织,适宜的种子细胞和性能优良的支架材料缺一不可。目的：探讨携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞后,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的可行性。方法：选取生长良好的第3代人脂肪间充质干细胞,用携带重组人血管内皮细胞生长因子165基因的慢病毒进行感染。将慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞成脂诱导14 d,油红O染色观察细胞的成脂能力;将慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞分别接种于壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上,MTT法检测细胞增殖能力;成脂诱导14 d后进行油红O染色,RT-PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶增殖物活化受体γ2的表达。结果与结论：成脂诱导14 d后,慢病毒感染与未感染的第3代人脂肪间充质干细胞均可见成熟脂肪细胞,组间差异不明显。慢病毒感染和未感染的第3代人脂肪间充质干细胞在改性丝素蛋白支架的生长曲线相近;成脂诱导后,油红O染色及RT-PCR均显示生成大量成熟脂肪细胞。表明携带重组人血管内皮细胞生长因子基因的慢病毒感染人脂肪间充质干细胞后,不影响其生长及成脂能力,与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料可成功构建组织工程化脂肪。     

Silk fibroin scaffolds loaded with angiogenic genes in adenovirus vectors for tissue regeneration

Vascularization remains a critical challenge in dermal tissue regeneration. In this study, a vascular endothelial growth factor (VEGF165) and angiopoietin‐1 (Ang‐1) dual gene coexpression vector that encoded green fluorescent protein (GFP) was constructed from an arginine–glycine–aspartic acid‐modified adenovirus. Silk fibroin (SF) scaffolds loaded with adenovirus vectors were fabricated by freeze‐drying method. In vitro, the human endothelial‐derived cell line EA.hy926 was infected with adenovirus vectors and then expressed GFP, secreted VEGF165 and Ang‐1, and promoted cell proliferation effectively. The VEGF165 and Ang‐1 genes loaded in the SF scaffolds significantly promoted the formation of abundant microvascular networks in the chick embryo chorioallantoic membrane. In vivo, angiogenic genes loaded in the scaffolds promoted vascularization and collagen deposition in scaffolds, thus effectively accelerating dermal tissue regeneration in a dorsal full‐thickness skin defect wound model in Sprague–Dawley rats. In conclusion, SF scaffolds loaded with arginine–glycine–aspartic acid‐modified adenovirus vectors encoding VEGF165 and Ang‐1 could stimulate the formation of vascular networks through the effective expression of target genes in vascular endothelial cells, thereby accelerating the regeneration of dermal tissue.