结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原？…

在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌热休克蛋白的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ＰＭＴ＿７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ＰＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组粒ＰＢＣＧ－ＴＢ７０中切出     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

含CpG基序的大肠杆菌DNA对柯萨奇病毒基因免疫的增强作用

柯萨奇病毒Ｂ组 (ＣＶＢ)有 6个血清型 ,即ＣＶＢ1～ 6。由于ＣＶＢ血清型多 ,采用传统疫苗预防本病难度较大。为此我们构建了ＣＶＢ1 Ｂ3型ＶＰ1基因重组质粒ｐＣＲ3 ｕｎｉＢ1Ｂ3,将该重组质粒转染后进行ＲＴ ＰＣＲ及免疫荧光检测 ,证明该表达系统可以在细胞内获得瞬时表达 ,并应用该质粒免疫ＢＡＬＢ ｃ小鼠 ,免疫后小鼠体内产生了相应的抗体 ,但是其抗体水平并不令人满意。为了获得更好的免疫效果 ,本研究探讨了大肠杆菌ＣｐＧＤＮＡ作为免疫佐剂以期增强ｐＣＲ3 ｕｎｉＢ1Ｂ3的免疫效果。材料和方法试剂盒和工具酶 :购自ＧＩＢＣＯ Ｂ…     

杜氏利什曼原虫热休克蛋白70的DNA疫苗表达载体构建及体内应答研究

以多聚酶链反应技术扩增获得了杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）全长基因序列，构建ＤＮＡ疫苗表达载体ｐＶＲ１０２０－ＨＳＰ７０。以脂质体法体外转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２，应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法证实构建的表达载体具有表达ＨＳＰ７０的能力。以１０μｇ的ＤＮＡ疫苗表达载体质粒经肌肉、皮下注射进行免疫，２周后即可出现抗－ＨＳＰ７０的抗体应答。建立了ＤＮＡ疫苗免疫应答的模型。     

丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨

目的：探索ＨＣＶ－ＤＮＡ核酸免疫效应。方法：将构建的重组体ｐＣＤ－ＨＣＶｓ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用ＥＬＩＳＡ和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测了免疫鼠血清抗体、脾细胞和ＰＢＭＣ对ＨＣＶ抗原的增殖反应。结果：重组体ｐＣＤ－ＨＣＶ１、ｐＣＤ－ＨＣＶ２和ｐＣＤ－ＨＣＶ３均可诱导小鼠（ｎ＝６）产生抗体（０．６６５￣０．７０７,ＯＤ值）和脾细胞对ＨＣＶ抗原增殖反应（ｎ＝６,ＳＩ为３．８９￣４．４７）,但各重组体间的     

含日本脑炎病毒pre-M/E蛋白基因真核表达质粒的构建及免疫效果观察

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时表达。大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击后特异性抗体的产生。     

CVB3VP1/pcDNA3真核表达质粒的构建及免疫效果观察

用ＲＴ ＰＣＲ从ＣＶＢ３ 感染细胞中扩增出ＶＰ１ 片段,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ 中,转化大肠杆菌Ｃ６００,扩增后的质粒经ＣｓＣｌ 密度梯度离心纯化,体外转染ＣＯＳ ７ 细胞,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测表达产物;并经胫骨前肌注射小鼠,每鼠１００μｇ／ 次,隔４ 周加强一次,共３ 次。免疫后不同时间检测抗体、淋巴细胞增殖反应等免疫指标。结果显示重组质粒体外转染真核细胞表达ＶＰ１ 蛋白,免疫小鼠后产生了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。表明ＣＶＢ３ ＶＰ１ ＤＮＡ疫苗获得初步有效结果。     

Molecular cloning and sequencing of the circumsporozoite protein gene from Plasmodium falciparum strain FCC-1/HN and expression of the gene in Mycobacteria

Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) has been used as a live bacterial vaccine to immunize more than 2 billion people against tuberculosis. In an attempt to use this vaccine strain as a vehicle for protective antigens, the Plasmodium falciparum gene from strain FCC-1/HN encoding circumsporozoite protein (CSP) was amplified from the P. falciparum genome, sequenced, and expressed in M. bovis BCG under the control of an expression cassette carrying the promoter of heat shock protein 70 (HSP70) from Mycobacterium tuberculosis. The recombinant shuttle plasmid pBCG/CSP was introduced into mycobacteria by electroporation, and the recombinant mycobacteria harboring pBCG/CSP could be induced by heating to express CSP; the molecular mass of recombinant CSP was about 42 kDa. This report of expression of the almost-full-length P. falciparum CSP gene in BCG provides scientific evidence for the application of the HSP70 promoter in expressing a foreign gene in BCG and in development of BCG as a multivalent vectoral vaccine for malaria.     

结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。     

Secretion of MPB64 Antigen by a Recominant Clone of Mycobacterium Smegmatis: Characterization and Application for the Diagnosis of Tuberculosis

MPB64, a specific antigen to Mycobaeterium tuberculosis complex (TB complex), was produced and secreted by a clone of M. smegmatis -MPB64 where the structural gene of MPB64 was inserted using a new mycobacteria, E. coli shuttle plasmid pNIS vector. Antibodies against the recombinant MPB64 (rMPB64) were used for the reverse particle latex agglutination (RPLA) test to detect the MPB64 antigen rapidly. RPLA tests were applied to the stock cultures and the clinical isolates of mycobacteria to identify TB complex. RPLA with anti-MPB64 antibody-coated latex beads completely distinguished TB complex from other mycobacteria. Thus, it is suggested that RPLA with anti-MPB64 antibody would be a new, easy and inexpensive method for the rapid diagnosis of tuberculosis.     

HSPs对呼吸道合胞病毒重组蛋白抗原免疫应答的调节作用

目的考察热休克蛋白HSP70对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白抗原G1F/M2免疫应答的调节作用。方法构建并表达了Javelin-G1F/M2重组蛋白,在G1F/M2的N端引入Javelin序列,通过该序列可以实现重组蛋白与HSP70蛋白高亲和力结合。以HSP70:Javelin-G1F/M2复合物等免疫Balb/c小鼠,用乳酸脱氢酶释放法测定CTL活性,ELISA法测定IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验测定血清中和抗体。结果经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;皮下免疫HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可诱导高滴度的IgG抗体和强的CTL应答,其抗体滴度和CTL应答强度均优于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物在诱导中和抗体方面与Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫基本相当。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可以诱导更强的IgG2a应答,IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值明显低于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫组和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫组。结论 HSP70可能通过增强CTL应答进一步纠正Th2型优势应答,使得Th1/Th2应答更加平衡。     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。     

Characterization of a linear epitope on Chlamydia trachomatis serovar L2 DnaK-like protein.

A cytoplasmic 75-kDa immunogen from Chlamydia trachomatis serovar L2 has previously been characterized as being similar to the Escherichia coli heat shock protein DnaK. We have localized a linear epitope for one monoclonal antibody specific for C. trachomatis DnaK. By use of a recombinant DNA technique, the epitope was limited to 14 amino acids. With synthetic peptides, the epitope was further limited to eight amino acids. Six of these amino acids are conserved in bovine HSP70, which has a known three-dimensional structure. The amino acid sequence homologous to the epitope is located in a linear part of the HSP70 molecule known as connect II.