骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退变研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSC)具有多向分化能力、免疫原性和免疫调节性等特点,可大量获取。许多学者对BMSC特性进行实验研究,并诱导其在体外和体内向椎间盘样细胞分化,已有大量研究成果证实将BMSC用于治疗椎间盘退变的可行性。近年也有将BMSC移植入椎间盘退变患者并获得延缓椎间盘退变效果的临床报道。该文就BMSC治疗椎间盘退变的基础研究和临床研究作一综述。     

骨髓间充质干细胞结合藻酸盐治疗椎间盘退变的实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSC）结合藻酸盐凝胶支架,治疗兔椎间盘退变的效果。方法将15只新西兰大白兔建立腰椎间盘退变模型,随机分为对照组、空白组和治疗组。体外培养兔BMSC,治疗组椎间隙注射BMSC结合藻酸盐凝胶支架,对照组注射藻酸盐凝胶,空白组注射生理盐水。应用核磁共振、免疫组化和生化分析,观察椎间盘退变的修复效果。结果治疗组影像学、病理组织学观察,以及蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量,均明显优于对照组和空白组,差异有统计学意义。结论 BMSC结合藻酸盐凝胶支架可用于治疗兔腰椎间盘退变。     

骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变

目的 观察兔骨髓间充质干细胞.壳聚糖凝胶复合体移植修复椎间盘髓核缺损退变的效果.方法 建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,将兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体注射移植入缺损退变模型中,兔继续培养4周后处死,取出移植修复的椎间盘进行组织HE染色、Aggre-can番红O染色及Ⅱ-collagen免疫组织化学染色,与正常椎间盘及未行移植的缺损退变椎间盘进行随机对照,检测移植修复的效果.结果 骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体可以在缺损的椎间盘中正常生长,并呈现向类髓核细胞分化的趋势,合成分泌Ⅱ-collagen和Aggrecan,维持原椎间盘髓核组织的生物学特性,而缺损退变组髓核组织纤维化、完整性丧失,水分丢失,Ⅱ-collagen合成明显减少(P<0.05).结论 兔骨髓间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合体能够修复椎间盘缺损退变.     

间充质干细胞移植治疗椎间盘退变疾病的研究进展

目的综述间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植治疗椎间盘退变疾病的研究现状。方法查阅近年来有关MSCs移植治疗椎间盘退变疾病的国内外相关文献,进行回顾及综合分析。结果椎间盘移植MSCs在一定的条件下能表达类软骨细胞表型,增加基质合成,缓解椎间盘退变。结论MSCs移植治疗椎间盘退变疾病是一种很有前途的方法。     

间充质干细胞在椎间盘退变中作用

腰背痛是临床常见疾病,近年来随着人口老龄化的加重,发病人数不断上升。研究发现椎间盘退变是引起腰背疼痛的主要原因之一,间充质干细胞具有的多能分化性、归巢及旁分泌特性能够补充椎间盘细胞并调节内部炎症反应,在修复椎间盘退变治疗腰背痛方面具有重要意义,近年来临床应用MSC治疗椎间盘退变取得了良好的疗效,组织工程学的发展也进一步提高了MSC治疗的效果及应用范围,本文通过查阅最新文献,总结了间充质干细胞在修复椎间盘退变中的作用机制以及在临床及组织工程学的研究应用进展,为腰背痛的治疗前景提供新的思路。     

移植骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响.方法 以各兔L2/3、L3/4、L4/5、L5/6节段分为正常组、退变组、成纤维细胞(SFs)移植对照组、MSCs移植治疗组.MSCs和SFs分别经绿色荧光蛋白(GFP)转染后,注射植入退变椎间盘的髓核.通过透射电镜观察退变椎间盘凋亡髓核细胞形态;用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测退变组织中髓核细胞凋亡相关基因bcl-2和box mRNA的表达;免疫荧光法标记髓核细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,并通过TUNEL法标记凋亡髓核细胞,激光共聚焦显微镜检测髓核细胞凋亡蛋白表达率和细胞凋亡比率.结果 透射电镜下,退变椎间盘中凋亡髓核细胞呈现出核染色质边集,空泡形成,核膜断裂,凋亡小体形成等变化.MSCs移植治疗组bcl-2 mRNA的表达量高于退变组和SFs移植对照组(P<0.05),bax mRNA的表达量与退变组差异无统计学意义(P>0.05).MSCs移植治疗组细胞凋亡率和Caspase-3表达率均高于正常组[细胞凋亡率分别为(16.75±2.14)%和(6.86±1.08)%;Caspase-3表达率分别为[(20.34±1.03)%和(6.09±0.77)%](P<0.05),低于退变组和SFs移植对照组[细胞凋亡率分别为(31.87±4.16)%和(29.02±2.16)%;Caspase-3表达率分别为(31.50±3.78)%和(30.20±4.93)%](P<0.05).结论 髓核细胞凋亡在椎间盘退变过程中起重要作用.MSCs移植能有效抑制椎间盘髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变过程.     

间充质干细胞治疗椎间盘退变基础和应用研究

通过生物学治疗逆转椎间盘退变是目前研究的热点。近年时应用间充质干细胞(MSC)治疗椎间盘退变进行了众多研究,体内外研究结果均表明MSC促进退变椎间盘内细胞再生,使髓核细胞分泌的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质表达增加。如何调节MSC向髓核细胞或类软骨细胞分化,目前认为低氧、生长因子刺激和三维培养是其主要影响因素。MSC治疗椎间盘退变的研究还不成熟,真正应用于临床治疗仍需更深入的研究。     

微囊化同种异体骨髓间充质干细胞移植预防兔椎间盘退变的实验研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记的微囊化同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMMSCs)移植预防椎间盘退变的可行性.方法:选用60只健康新西兰大白兔.随机平均分为A、B、C、D、E 5组,每组12只.A、B、C、D组应用髓核抽吸法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型,取同种异体兔bMMSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用SHO标记后行微囊化,于造模手术当时植入(A组)兔手术节段椎间盘内;B组植入未微囊化bMMSCs;C组移植空微囊;D组仅制作模型,不移植;E组为正常对照组.分别于建模后2、4、6、8周时用MRI扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪,并于相应时间点处死动物后取L2/3、L3/4、L4/5髓核组织,用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化.所得数据进行统计学分析.结果:bMMSCs能被SPIO有效标记,应用MRI扫描可观察到其在体内的分布,8周时MRI图像与4周时相比,干细胞由注射部位向周边发生了迁徙.建模后2、4、6、8周各时间点.A组髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量均高于B组、C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05);B组均高于C组及D组,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点E组与B组、C组及D组相比差异有统计学意义(P<0.05);术后6、8周时A组与E组之间差异无统计学意义(P>0.05);各时间点C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:微囊化bMMSCs移植后能恢复兔髓核中细胞外基质含量,其效果优于单纯bMMSCs移植.     

脐带华通胶间充质干细胞移植对退变椎间盘影响的实验研究

目的:探讨人华通胶间充质干细胞(Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)移植对犬退变椎间盘的影响。方法:从新生儿脐带中提取WJMSCs,取增殖良好的第3代细胞,用含有绿色荧光蛋白的腺相关病毒(r AAV2-EGFP)感染标记细胞。选择20只健康成年比格犬作为实验动物,使用穿刺抽吸髓核组织法建立椎间盘退变模型(L4/5、L5/6、L6/7)。4周后将犬各节段椎间盘进行分组:L3/4为对照组(A组);L4/5为退变组(B组);L5/6为注射组(C组),注射生理盐水;L6/7为移植组(D组),移植绿色荧光蛋白标记的WJMSCs细胞悬液。造模术前、术后4、8、12、24周行腰椎X线及MRI检查。24周后处死动物取材进行冰冻切片荧光、HE染色及番红O染色等组织学检测,提取髓核组织总RNA,反转录后行Real Time PCR检测,观察蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9及Ⅰ型胶原基因表达变化。结果:分离培养的WJMSCs贴壁生长,呈梭形形态,r AAV2-EGFP病毒感染后第3天表达绿色荧光。影像学检查结果显示各组椎间盘高度指数及相对灰度指数在造模术前、术后第4周无统计学差异,术后8、12、24周,D组椎间盘相对高度指数及相对灰度指数较B、C组高(P0.05),比A组低(P0.05)。术后24周,D组髓核组织冰冻切片内能够检测到GFP阳性的WJMSC细胞,HE染色显示D组髓核组织退变比B组和C组轻,番红O染色结果显示D组染色较B组和C组深,基因表达检测结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9基因表达比B、C组高(P0.05),但比A组低(P0.05)。结论:人WJMSCs移植入犬退变椎间盘内能够存活,促进椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖合成,维持椎间盘高度及髓核含水量,能够有效延缓椎间盘退变进展。     

骨髓间充质干细胞移植治疗腰椎间盘退变的研究进展

腰痛是骨科的常见症状,给患者和社会带来了沉重的负担。研究表明大多数腰痛和椎间盘退变有关，而目前的治疗都只能缓解症状，不能逆转椎间盘退变。随着对椎间盘退变病理认识的深入,采用生物学方法逆转椎间盘退变成为可能。细胞治疗和组织工程就是其中方法之一。笔者对骨髓间充质干细胞（BMSC）作为种子细胞治疗椎间盘退变的研究进展做一综述。     

间充质干细胞治疗椎间盘退行性变的研究进展

<正>椎间盘退行性变(IDD)是引起下腰痛的主要病因之一~([1]),IDD导致的椎间隙狭窄是下腰痛重要发病机制~([2-3])。成人椎间盘是人体最大的无血管组织且细胞含量较少~([4])。IDD不同于正常衰老,衰老属于生理现象,不引起疼痛,而IDD则会引起髓核细胞(NPC)活性下降、数量减少,椎间隙高度丢失等,从而产生下腰痛。IDD的非手术治疗~([5])和手术     

Relationship between neovascularization and degenerative changes in herniated lumbar intervertebral discs

Purpose

Lumbar disc degeneration may be associated with intensity of neovascularization in disc herniations. Our study was designed to evaluate how much the severity of histodegeneration is related to the development of neovascularization and to the level of pleiotrophin in the herniated lumbar discs.

Methods

Surgically excised lumbar disc specimens were obtained from 29 patients with noncontained (i.e., extruding through the posterior longitudinal ligament) and 21 patients with contained disc herniations. The histodegeneration scores and levels of neovascularization were estimated according to semiquantitative analysis in lumbar disc and endplate samples. Immunohistochemical staining were performed to identify the newly formed blood vessels and to detect the presence of pleiotrophin in the specimens.

Results

Higher levels of disc and endplate neovascularity were registered in noncontained herniations. The level of neovascularization was significantly related to the score of histodegeneration in the herniated disc tissues but not in the endplate specimens. Both contained and noncontained herniations had the highest values of histodegeneration in conjunction with the highest level of neovascularization but the relations between neovascularity and degenerative changes remained to be significant only in the group of noncontained herniations. Registration or frequency of pleiotrophin positive cells did not correlate significantly with histodegeneration or level of neovascularization in the disc samples.

Conclusion

Severe histodegeneration of the lumbar disc herniations is associated with enhanced neovascularization and potentially also spontaneous regression of the herniated tissue.     

非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激环境中退变髓核细胞凋亡的保护研究

目的BMSCs移植可修复椎间盘退变,但确切修复机制尚不明确。探讨非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激诱导退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡的保护作用,了解BMSCs移植修复椎间盘退变的可能机制。方法密度梯度离心联合贴壁法分离、培养正常人BMSCs,并鉴定CD34、CD45、CD13细胞表面分子。胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘NPCs,HE染色、倒置相差显微镜观察NPCs细胞形态,甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色鉴定NPCs的类软骨细胞表型。取第3代BMSCs和第1代NPCs按共培养体系不同分为4组:A组单纯NPC(s1×106个)培养,不行凋亡诱导;B组BMSCs(1×106个)与NPCs(1×106个)共培养;C组BMSCs(3×105个)与NPCs(1×106个)共培养;D组单纯NPCs(1×106个)培养,行凋亡诱导。B、C、D组分别于共培养3、7d加入0.1mmolH2O2作用20min诱导NPCs凋亡。胰蛋白酶消化收集各组NPCs,行DAPI染色观察细胞核形态,Annexin-V/碘化丙啶染色、流式细胞仪计算凋亡率,半定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因转录水平,Western-blot检测Caspase-3蛋白含量。结果成功分离并培养人BMSCs和人退变椎间盘NPCs;BMSCs鉴定呈CD34-、CD45-、CD13+;第1代NPCs呈梭形或多角形,于胞质内表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖。DAPI染色示凋亡的NPCs可见细胞核固缩;共培养3、7d后,B组(29.26%±8.90%,18.03%±2.25%)及C组(37.10%±3.28%,13.93%±1.25%)细胞凋亡率均低于D组(54.90%±5.97%,26.97%±3.10%),高于A组(15.67%±1.74%,8.87%±0.15%),比较差异均有统计学意义(P0.05)。半定量RT-PCR检测示B、D组髓核细胞Bcl-2的转录水平提高(P0.05),Bax的转录水平无显著变化(P0.05);Western blot检测示B、C组NPCs的Cas-pase-3蛋白表达量低于D组,高于A组,差异有统计学意义(P0.05)。结论非接触共培养条件下人BMSCs可一定程度保护氧化应激诱导的退变NPCs凋亡,BMSCs共培养预处理的NPCs可能通过降低Bax/Bcl-2的转录比例来增强抗凋亡能力。     

软骨调节素在成人退变椎间盘中的表达

目的 利用分子生物学及免疫组化方法研究软骨调节素(ChM-Ⅰ)在成人退变椎间盘细胞及椎间盘组织中的表达情况.方法 2009年3月至4月取3例因腰椎间盘退变性疾病而需行后路椎间融合患者的椎间盘组织分别进行髓核及纤维环细胞培养.取部分原代细胞利用RT-PCR和Western blot研究ChM-Ⅰ mRNA和蛋白在成人退变椎间盘细胞中的表达情况.利用real-time PCR和Western blot研究不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对髓核细胞和纤维环细胞ChM-Ⅰ mRNA和蛋白表达的影响.收集2008年10月至2009年10月因腰椎间盘退变性疾病而行手术切除的椎间盘组织标本26例,根据MRI表现退变程度为Ⅲ～V级,作为退变组.收集同期因脊柱肿瘤行手术治疗时切除的椎间盘标本6例,退变程度Ⅰ级,作为对照组.利用免疫组化方法研究ChM-Ⅰ在不同退变程度椎间盘组织中的表达情况.结果 RT-PCR、Western blot显示ChM-Ⅰ在椎间盘髓核细胞及纤维环细胞中均有表达.bFGF可抑制ChM-Ⅰ在髓核及纤维环细胞中的表达,且呈剂量依赖性(P＜0.05).ChM-Ⅰ在对照组椎间盘组织中表达量很低,阳性细胞率为0.12±0.03,而在椎间盘发生退变后其表达量明显升高,退变组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 髓核细胞及纤维环细胞可表达ChM-Ⅰ,bFGF可明显抑制ChM-Ⅰ mRNA及蛋白的表达.椎间盘发生退变后ChM-Ⅰ表达明显升高,提示其可能在椎间盘退变的病理过程中发挥一定的作用.

Abstract：

Objectives To investigate the expression of chondromodulin-1(ChM-Ⅰ)in human adult degenerative intervertebral disc(IVD)cells and the relationship between ChM-Ⅰ expression and disc degeneration.Methods Three degenerated disc specimens obtained from patients in the treatment of disc degenerative disease from March to April 2009 were used for cell culture.ChM-Ⅰ expression in ⅣD cells was examined by RT-PCR and Western blot.The effect of basic fibroblast growth factor(bFGF)on the expression of ChM-Ⅰ was assessed by real-time PCR and Western blot.From October 2008 to October 2009,26 human ⅣD tissues were obtained from patients in the surgical treatment of disc degenerative disease at different stage of degeneration according to MRI.Six IVD tissues removed from patients with metastatic spinal tumor were used as normal control.The expression of ChM-Ⅰ determined by immunohistochemical analysis was correlated with MRI degeneration grade.Results RT-PCR and Western blot examination showed that ChM-Ⅰ was expressed in both adult degenerative anulus fibrosus and nucleus pulposus cells.The mRNA and protein expression of ChM-Ⅰ were both down-regulated by administration of bFGF with dose-dependent way(P＜0.05).Immunohistochemical analysis showed the percent of ChM-Ⅰ immunopositive cells in the control group was 0.12 ± 0.03,and the number increased significantly in the advanced degeneration group(P＜ 0.05).Conclusions The current results demonstrate that ⅣD cells express ChM-Ⅰ.Administration of bFGF down-regulates the expression of ChM- Ⅰ.The expression of ChM-Ⅰ is correlated with the degree of ⅣD degeneration which means it may involve in the process of ⅣD degeneration.     

番茄红素对D-半乳糖诱导衰老大鼠椎间盘的影响

目的 观察D-半乳糖诱导衰老大鼠模型椎间盘等的变化及番茄红素对其影响.方法 将30只SD大鼠随机分成对照组、模型组和干预组.模型组和干预组每天颈部皮下注射D-半乳糖,对照组用等量生理盐水替代,干预组每天用番茄红素灌胃.各组每周称体重,12周后处死并取椎间盘及血清观测.结果 与对照组相比,模型组椎间盘明显退变,干预组椎间盘轻微退变;模型组体重减轻(P<0.05)、抗氧化水平下降明显(P<0.05.P<0.01).而干预组较模型组体重及抗氧化水平有所升高(P<0.05·P<0.01).结论 D-半乳糖在诱导大鼠衰老的过程中可诱发椎间盘退变.而番茄红素可延缓椎间盘退变的进展.     

骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退行性病变的研究进展

对椎间盘退变机制、BMSCs生物学特性、支架材料及细胞因子认识的深入,为BMSCs修复退变的椎间盘组织奠定了基础。研究表明,BMSCs治疗椎间盘退行性病变具有可行性,临床应用前景广阔。本文就BMSCs治疗椎间盘退行性病变的研究进展进行综述。     

水通道蛋白1在不同程度退变腰椎间盘中的表达及意义

目的 观察水通道蛋白1在退变腰椎间盘组织中的表达变化,研究其与椎间盘退变的关系。方法 实验组取材于经手术治疗腰椎间盘突出症患者椎间盘标本30例,突出型、脱出型、游离型各10例;对照组取材于腰椎损伤致椎体骨折患者切除椎间盘10例。应用免疫组织化学法检测水通道蛋白1在椎间盘组织中的表达。结果 （1）苏木精-伊红染色显示,对照组椎间盘组织仍保持着致密的板层结构,实验组椎间盘组织多呈纤维化样改变。（2）各组髓核细胞中水通道蛋白1表达均明显高于同组纤维环细胞中的表达(P≤0.01)。（3）实验组突出型椎间盘标本髓核及纤维环细胞中水通道蛋白1表达明显低于对照组(P＜0.01),脱出型和游离型椎间盘标本中水通道蛋白1表达明显低于突出型 (P＜0.01)。结论 水通道蛋白1随着椎间盘突出、脱出、游离不同程度退变,表达呈逐渐下降趋势。     

Validation of the intervertebral disc histological degeneration score in cervical intervertebral discs and their end plates

Background Context

Vertebral joints consist of intervertebral discs (IVDs) and cartilaginous end plates (EP) that lie superiorly and inferiorly to the IVDs and separate them from the adjacent vertebral bodies. With aging, both IVDs and EPs undergo degeneration. The Histologic Degeneration Score (HDS) is a grading system that microscopically evaluates the degree of degeneration in lumbar discs and predicts it with high accuracy basing on several histological markers of IVD and EP. There is currently a lack of validated histologic grading schemes for cervical spine degeneration.

正常与退变髓核的髓核间充质干细胞代谢活性及干性基因表达的比较

【摘要】 目的：比较来源于正常与退变髓核的髓核间充质干细胞（NPMSCs）的细胞代谢活性及干性基因表达情况。方法：收集6例非退变患者髓核组织（正常组）与6例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织（退变组）,采用酶消化法分离细胞,应用标准间充质干细胞培养基（standard MSC culture medium）进行细胞培养并观察细胞形态。两组内各取1例分离得到的细胞进行流式细胞仪检测间充质干细胞表面蛋白分子标记CD90、CD105、CD73、CD45、CD34及人类白细胞抗原（HLA）-DR表达情况;并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化,诱导28d后分别应用茜素红染色鉴定细胞成骨能力、油红O染色鉴定细胞成脂能力、甲苯胺蓝染色鉴定细胞成软骨分化能力,并按照国际干细胞治疗协会（ISCT）提出的间充质干细胞的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。采用CCK-8检测两组P2代NPMSCs的代谢活力。提取两组每例P2代细胞总RNA,行RT-PCR检测P2代细胞“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达情况。结果：两组P0代细胞均贴壁生长,形态学方面两组并无明显差异。免疫表型鉴定显示正常组和退变组间充质干细胞表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、98％、95%以上,两组均低表达造血细胞标志物CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实正常组与退变组细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。上述结果证实分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后5d、7d、9d、11d、13d正常组细胞活性均强于退变组,两组细胞活性有统计学差异（P<0.05）。正常组“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达量分别为退变组的4.63±1.17、7.36±1.19倍,正常组均明显高于退变组（P<0.05）。结论：正常与退变髓核组织内均存在NPMSCs,但正常椎间盘来源的NPMSCs具有较强的细胞代谢活性,较”强的“干性维持”基因表达。