重组人肿瘤坏死因子及其与阿霉素联合抗人肝癌的实验研究

本研究采用体外细胞毒方法（ＭＴＴ）检测了重组人肿瘤坏死因子（ｒＨＴＮＦ）和）（或）阿霉素（ＡＤＭ）对肝癌细胞株Ｓ ＭＭＣ－７７２１及Ｂ ＭＭＣ７７２１及Ｂｅｌ－７４０２的细胞毒效应。结果表明：ｒＨＴＮＦ＇ＡＤＭ对两肝癌细胞株的毒性有明显差异，ｒＨＴＮＦ与ＡＤＭ联合应用的体外细胞毒试验显示良好的协同增强效应，在此基础上，选用ＳＭＭＣ－７７２１细胞株进行棵鼠移植瘤试验，观察ｒＨＴＮＦ与ＡＤＭ联合应用的     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导肝癌细胞凋亡的研究

方法 采用原位杂交方法检测肝癌组织、肝癌细胞株以及正常肝组织中TRAILR的表达。采用不同浓度TRAIL蛋白处理肝癌细胞株Hep2和SMMC7721,应用流式细胞仪和原位末端标记,观察经药物处理前后该细胞株的凋亡发生率。结果 60例肝癌组织及20例正常肝组织均表达死亡受体DR5和DR4,但肝癌组织DR表达量显著强于正常肝组织。54例(90．0％)肝癌组织不表达诱捕受体DcR1,25例(41．7％)肝癌组织不表达DcR2,而20例正常肝组织均表达DcR。肝癌组织中DR的高表达及DcR的低表达,不同于正常肝组织中DR的低表达及DcR的高表达,两者间差异有显著性。两种肝癌细胞株中均可检测到DR5、DR4、DcR2的表达,但DcR1表达缺失。肝癌组织中DR的表达与肿瘤的分化、肿瘤分期有关,低分化的肿瘤DR表达减少(P＜0．01),Ⅲ、Ⅳ期肿瘤DR表达显著低于I、Ⅱ期(P＜0．05)。DR表达与患者的性别、年龄、HBsAg阳性与否、AFP水平、肿瘤大小以及是否转移无关。经TRAIL(100ng/ml)处理24h,肝癌细胞凋亡发生率约10％,而Jurkat细胞凋亡率达70％以上,胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。结论 肝细胞肝癌普遍存在TRAILR的表达,并存在受体类型的表达差异。但单一的TRAIL治疗只能有限的诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721发生凋亡,HCC对TRAIL诱导的凋亡存在耐药现象。     

肿瘤坏死因子α和/或化疗药物联合应用对肝癌细胞系的协同细胞毒作用

本文采用体外细胞毒试验方法(MTT),检测了重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)和/或6种常用化疗药物包括阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、足叶乙甙(VP-16)、异环磷酰胺(IFO).对肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7402的细胞毒效应.结果表明,rhTNF-α对两种肝癌细胞株的细胞毒作用有明显差异;两种肝癌细胞株对六种化疗药的敏感性不同,其中对ADM、DDP、MMC的敏感性较高.rhTNF-α与六种化疗药物联合应用的结果表明,rhTNF-α与ADM、DDP、VP-16有协同增强抗瘤效应,而rhTNF-α与MMC、CBP、IFO仅呈简单的叠加效应.体外细胞毒试验证明,rhTNF-α与某些化疗药物有协同作用,在临床肿瘤治疗中联合应用有可能提高疗效.     

三氧化二砷对人肝癌HepG2细胞内活性氧水平的影响

[目的]探讨三氧化二砷（As2O3）对人肝癌细胞生长抑制和诱导凋亡作用及其对细胞内活性氧（ROS）水平的影响。[方法]用MTT法、DNALadder检测及流式细胞术等观察As2O3对人肝癌细胞株HepG2的生长抑制和诱导凋亡作用及细胞内ROS的变化。[结果]As2O3能明显抑制HepG2细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性。DNALadder检测示,121μmol／L As2O3处理HepG2细胞48h开始出现DNALadder条带。流式细胞仪分析显示As2O3处理人肝癌细胞HepG2 12、24、36h后细胞内ROS水平较对照组明显升高（P〈0．01）,且呈时间依赖性。[结论]As20,可通过抑制人肝癌细胞HepG2增殖和提高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。     

分泌肿瘤坏死因子的基因工程细胞对HepG2细胞的抑制作用

目的自行建立分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,将其与肝癌细胞共培养,观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞表达的情况及对人肝癌细胞的抑制作用。方法(1)建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)观察体外培养中分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞对人肝癌细胞的抑制作用,于不同的时间点,用MTT法检测490 nm下的吸光度值。结果RT-PCR、Western blot和ELISA等技术检测表明hTNFα/293 细胞组和TNFα阳性组对共培养的HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,且具有良好的量效关系。结论提示TNF-α/293基因细胞可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外;体外培养的人肿瘤坏死因子基因的工程细胞,所分泌肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞增殖有明显抑制效应,且呈现出良好的数量依赖关系。     

细胞同步化对肿瘤坏死因子诱导Hela细胞凋亡的影响

目的 研究细胞周期时相对肿瘤坏死因子（TNF）诱导Hela细胞凋亡的影响。方法 应用胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法将培养的Hela细胞同步化,采用MTT法、流式细胞术和荧光染色,分析同步化的Hela细胞和正常培养的Hela细胞对TNF（加放线菌酮增效）诱导凋亡的敏感性。结果 同步化Hela细胞较正常培养的Hela细胞对TNF诱导调亡的敏感性增强。结论 TNF诱导Hela细胞凋亡与细胞周期有关。     

三氧化二砷对肝癌HepG2细胞侵袭转移及USP22蛋白表达的影响

目的:探究不同浓度三氧化二砷(As2O3)对肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响以及对HepG2细胞中USP22蛋白表达的影响,进一步完善其分子机制。方法:CCK8细胞增殖实验检测不同浓度As2O3在不同时间点对HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕和Transwell方法检测HepG2细胞在不同浓度As2O3作用下侵袭转移能力的变化;Western blot检测As2O3作用下HepG2细胞中USP22蛋白的表达水平。结果:随着As2O3浓度和作用时间的增加,HepG2细胞增殖明显受到抑制。与对照组相比,24 h时分别用2、4、8 μmol/L的As2O3处理的HepG2细胞侵袭转移能力降低,细胞中USP22蛋白表达水平明显下降。结论:As2O3可抑制人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力,其分子机制可能与下调的USP22蛋白水平相关。     

拓扑替康诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的初步研究

背景与目的:拓扑替康(topotecan,TPT)是新一代水溶性、半合成喜树碱类衍生物,系拓扑异构酶I抑制剂、细胞周期特异性抗肿瘤药物;肝癌为我国发病率居第三位的恶性肿瘤,现有治疗方法的临床疗效均不理想。本文研究TPT诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的作用,及其细胞毒作用。方法:运用MTT、HE染色、透射电镜、流式细胞仪、免疫组化技术等实验方法,对TPT杀伤HepG2细胞的程度进行了测定并观察了其诱导凋亡的过程。结果:TPT能通过诱导HepG2细胞凋亡的方式,杀伤HepG2细胞,TPT对HepG2细胞具有较强的体外杀伤作用,并存在明显的剂量、时间依赖关系,IC50约为95μg/L。TPT将HepG2细胞阻断在S期,并进一步诱导其凋亡。凋亡形态特征表现为典型的间期凋亡:细胞核染色质固缩,呈新月形聚集于核膜周缘,胞质浓缩,出现空泡。在TPT诱导HepG2细胞凋亡的过程中,不影响bcl-2基因蛋白正常表达(P>0.05)。结论:TPT能诱导HepG2细胞凋亡,细胞毒性较强。     

槲皮素、姜黄素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡作用的比较

目的:探讨槲皮素和姜黄素对人肝癌HepG2细胞株增殖及凋亡的作用。方法:不同质量浓度的槲皮素(0、10、20、50、100μmol/L)和姜黄素(0、2、5、10、20μmol/L)分别作用HepG2细胞24、48、72 h,以As2O3(0、2、5、10、20μmol/L)为阳性对照,MTT法检测HepG2细胞的增殖,流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡。结果:槲皮素、姜黄素及As2O3作用后,HepG2细胞形态发生变化、生长速率变慢,HepG2增殖率随着时间和药物浓度的增加逐渐减低,72 h时3种药物高浓度组HepG2细胞增殖率分别为(31±5.8)%、(51±4.6)%、(54±5.8)%。槲皮素和姜黄素均有明显的促凋亡作用,并呈时间和浓度依赖性;高浓度(100μmol/L)槲皮素作用最强,相同浓度下的姜黄素与As2O3作用相当。结论:槲皮素和姜黄素能明显抑制HepG2细胞增殖,促进其凋亡,并且这种作用强于As2O3。     

肝癌细胞系HepG2细胞周期与端粒酶活性及HBV复制的关系

背景与目的:大量研究表明端粒酶活性与肿瘤细胞的发生、发展密切相关,而且乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)复制、端粒酶活性高低与细胞周期亦存在相关性。为进一步证实其内在联系,本实验探讨无血清培养、全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)对HBVDNA转染的人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响以及细胞周期与端粒酶活性、HBV复制状态的关系。方法:分别用RA、无血清培养处理HepG2细胞并与对照组比较。细胞周期用流式细胞仪测定,端粒酶活性用TRAP-PCR-ELISA定量检测,HBVDNA分别用荧光PCR定量检测及斑点杂交半定量检测,HBsAg和HBeAg用ELISA方法定量检测。结果:RA、无血清培养使HepG2细胞生长受抑制,停滞在G0/G1期(RA组、无血清培养组G0/G1期时相百分比分别为68.3%、65.2%),端粒酶活性明显下降(RA组、无血清培养组代表端粒酶活性的吸光度A值分别为0.32、0.41),与对照组(G0/G1期时相百分比为43.1%,代表端粒酶活性吸光度A值为1.34)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01);细胞培养液中HBVDNA、HBsAg和HBeAg含量显著增加(RA组分别为4.4×106copies/ml、3.5、19.8;无血清培养组分别为5.1×106copies/ml、3.7、22.5),与对照组(分别为1.2×106copies/ml、1.3、13.4)相比,两者之间有显著性差异(P<0.01)。结论:端粒     

肿瘤坏死因子联合环磷酰胺对H22肝癌小鼠的抗肿瘤作用

肿瘤坏死因子（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）和环磷酰胺（Ｃｙｃｌｏ－ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＹ）联合应用对Ｈ２２肝癌小鼠具有显著协同抗肿瘤作用，这种协同作用与二者用药的先后次序有显著关系。ＴＮＦ、ＣＹ单独应用及ＣＹ先于ＴＮＦ应用的抗瘤作用差（抑瘤率２５．６０％，ＩＬＳ３２．６４％），ＴＮＦ与ＣＹ同时联合应用比单独应用的抗瘤作用略增强（抑瘤率３４．７２％，ＩＬＳ５４．７４％），但如先用ＴＮＦ后用ＣＹ抗瘤作用则显著增强，可以明显改善Ｈ２２肝癌小鼠的免疫功能（ＮＫ活性增长率４９．７０％，ＬＡＫ活性增长率４６．３０％），明显抑制实体瘤生长（抑瘤率６０．１２％），显著延长Ｈ２２肝癌小鼠（腹水型）生存期（ＩＬＳ１０４．７８％），并且有２５％Ｈ２２肝癌小鼠完全治愈。提示：联合ＴＮＦ与ＣＹ治疗肿瘤，ＴＮＦ、ＣＹ序贯用药方法为最佳方案。     

大黄素在体外诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡的初步研究

背景与目的:大黄素(3-甲基-1,6,8-三羟蒽醌)是大黄等多种中药的有效成分之一。研究表明大黄素对于乳腺癌细胞、肺癌细胞的生长具有抑制作用,但目前大黄素抗肿瘤的作用机理尚不明确。本研究拟讨论大黄素在体外对肝癌细胞HepG2的作用及其机理。方法:应用MTT、软琼脂克隆形成、DNAladder凝胶电泳及流式细胞术等方法,研究中药单体大黄素对肝癌细胞HepG2生长增殖的影响以及作用机理。结果:大黄素在较低浓度可抑制肿瘤细胞的生长,MTT实验测得的半数抑制浓度(IC50)为(36±2.6)μg/ml。在软琼脂实验中,大黄素可以浓度依赖的方式抑制细胞克隆的形成。经DNAladder及流式细胞仪检测发现,大黄素能诱导HepG2细胞凋亡,与阴性对照相比,随着药物浓度从10μg/ml增加到20μg/ml,AnnexinV染色细胞显著增多,由27.3%增至59.6%;当药物浓度增至40μg/ml时,培养液中几乎无活细胞,由碘化丙啶和AnnexinV双重标记的凋亡后期以继发性坏死细胞为主。结论:中药单体大黄素在体外能抑制肝癌细胞HepG2的生长增殖,并能诱导该细胞凋亡。     

三氧化二砷对人不同种类卵巢癌细胞系的体外作用

目的；研究新型抗癌药物三氧化二砷对人不同种类卵巢癌细胞系细胞体外生长的作用。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法，测定不同浓度三氧化二砷作用后3AO细胞的凋亡率及细胞周期的变化；通过吖啶橙染色，荧光显微镜观察三氧化二砷作用后SKOV3细胞的形态变化。结果：三氧化二坤可有效的抑制3AO、SKOV3、TYK细胞的生长，具有时间、浓度依赖性（P＜0.05）；不同细胞株之间的细胞生长抑制率差异无显著性（P＞0.05）；在一定浓度范围内，三氧化二砷诱导3AO细胞的凋亡率具有时间、浓度依赖性（P＜0.05）；3.0μmol/L是诱导细胞凋亡的最佳浓度；三氧化二砷低浓度时阻滞3AO细胞于S期，高浓度时选择性诱导S期细胞凋亡；三氧化二砷作用后，SKOV3细胞呈现典型的凋亡细胞形态特征。结论：三氧化二砷通过诱导S期细胞凋亡而抑制人卵巢癌细胞的生长，具有量效性、时效性及周期特异性。     

重组人肿瘤坏死因子治疗原发性肝癌的实验研究

体外细胞毒实验测试发现重组人肿瘤坏死因子ａｌｐｈａ（ｒＨＴＮＦ_α）对体外培养的人原发性肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１和ＢＥＬ７４０４有较强的细胞毒作用，这种作用具有剂量依赖性。形态学研究表明，受ｒＨＴＮＦ作用的肝癌细胞呈现调亡细胞的特征，即胞核固缩，部分成片状，细胞变小，聚集成团落，在体外实验的基础上，对ＳＭＭＣ－７７２１，细胞的裸鼠人肝癌模型进行实验治疗，结果提示：瘤内单独注射ｒＨＴＮＦ（５００Ｕ／只，ｑｄｘ３），即有一定抗瘤效应，合用ＤＤＰ后效果明显，这些结果预示ｒＨＴＮＦ在肝癌治疗中的潜在意义。     

三氧化二砷诱导人肝癌细胞株凋亡的初步研究

细胞凋亡在肿瘤治疗学上的意义日益得到人们的重视.我们观察了中药砒霜的主要成分——三氧化二砷(As_2O_3)对肝癌细胞株的诱导凋亡作用,以探索药物治疗肝癌的新途径.1.材料与方法:(1)药物:0.1%As_2O_3溶液(癌灵Ⅰ号),哈尔滨医科大学第一附属医院药剂科惠赠.(2)细胞株:人肝癌细胞株SMMC-7721.(3)方法:MTT法观察细胞的增殖率,AO/EB荧光染色观察细胞的形态学改变,流式细胞仪检测凋亡率及细胞周期变化.2.结果:As_2O_3对SMMC-7721肝癌细胞株的生长有显著抑制作用,抑制作用强度随浓度提高、作用时间延长而增加.经2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml As_2O_3作用24h,SMMC-7721细胞株在荧光染色时,显微镜下均呈现典型的凋亡形态学改变,如核染色体凝结、固缩成块状,或染色体沿核膜成新月体形排列,或细胞核崩解碎裂,可见部分细胞呈出芽的表现.流式细胞促检测各实验组均见有亚G_1峰.细胞经1μg/     

肿瘤坏死因子体外对宫颈癌细胞系细胞毒作用观察

本实验用非同位素细胞毒试验方法观察了肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）对宫颈来源的三个细胞系的体外杀伤作用，并比较重组人干扰素（ＩＦＮγ）对ＴＮＦα细胞毒性的协同作用。结果表明，单一ＴＮＦα对宫颈良、恶性肿瘤细胞均呈微弱的细胞毒作用，但ＩＦＮγ与ＴＮＦα共同作用则对宫颈癌来源的细胞系显示明显杀伤作用（Ｐ＜０．０１），对源于正常、良性肿瘤的细胞系无显著作用（Ｐ＞０．０５）。     

三氧化二砷与重组人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体协同诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)和重组人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(rhTRAIL)协同诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的机制.方法 分别以As2O3、rhTRAIL及两者联合处理人胃腺癌细胞株SGC7901,用AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡,用DiOC6荧光染色流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(△Ψm),比色法测定细胞Caspase-8、9活性的变化,观察Caspase-8阻断剂(Z-IETD-fmk)与二硫基还原剂(DTT)对SGC7901细胞凋亡、ΔΨm和Caspase-8、9活性变化的影响.结果 As2O3和rhTRAIL均可以导致SGC7901细胞ΔΨm 随时间延长逐渐下降,两者联用可增加SGC7901细胞ΔΨm下降.Caspase-8阻断剂Z-IETD-fmk可减少rhTRAIL诱导的SGC7901细胞发生凋亡与ΔΨm下降,但不影响As2O3的上述作用.二硫基还原剂(DTT)可减少As2O3诱导的SGC7901细胞凋亡与ΔΨm下降,但不影响rhTRAIL的上述作用.As2O3可导致SGC7901细胞Caspase-9活性升高,这种作用可被二硫基还原剂部分取消,但不受Caspase-8阻断剂的影响;rhTRAIL可导致SGC7901细胞Caspase-8、9活性升高,这种作用可被Caspase-8阻断剂部分取消,但不受二硫基还原剂的影响.结论 As2与rhTRAIL通过不同机制激活SGC7901细胞凋亡的线粒体途径,两者联合增强了线粒体途径的激活,从而在诱导胃癌细胞凋亡方面形成协同作用.     

恩度与阿霉素联用对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用

目的:体外观察恩度与阿霉素联用对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响.方法:采用MTT 法观察不同浓度阿霉素、恩度及联合应用对HepG2细胞生长的抑制作用,采用流式细胞仪检测上述药物单独或联合应用对HepG2细胞的凋亡及周期影响.结果:化疗药物单独应用时,对HepG2细胞的抑制作用呈明显的剂量效应依赖关系.阿霉素与恩度均可诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,且联用时有协同作用.结论:恩度与化疗药物联合应用时的具有协同效应.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。