成人破骨细胞的体外培养

目的 建立成人破骨细胞体外培养的方法，观察成骨细胞对破骨细胞分化、增殖和功能的影响，为进一步研究补肾中药防治骨溶解和骨质疏松症提供基础。材料和方法 从成人骨髓中提取单核细胞，以1，25—(OH)2D3作为刺激因子，分3组培养：单核细胞与成骨细胞共同培养，单核细胞单独培养，单核细胞与成骨细胞条件培养液培养。生物显微镜下观察细胞的分化过程，HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色方法作组织化学观察，扫描电镜(SEM)观察骨吸收功能。结果 在单核细胞与成骨细胞共同培养组，可见单核细胞逐步融合成多核细胞；HE染色和Trap染色可见阳性多核细胞；扫描电镜观察可见骨片上有骨吸收陷窝形成。其他两组则未得到上述结果。结论 成人骨髓单核细胞在一定培养条件下能分化成熟为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞：Trap染色阳性，具有骨吸收功能。与成骨细胞的直接接触是破骨细胞分化、增殖和发挥功能的必不可少的条件。     

破骨细胞体外培养方法的建立与形态观察

1　材料和方法1 1　骨磨片制备　新鲜牛股骨皮质锯成 6ｍｍ× 6ｍｍ×2 0 0 μｍ的小块 ,再磨成 10 μｍ厚。1 2　破骨细胞分离培养　拉颈处死出生 2 4ｈ内的新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,75 %乙醇浸泡 5ｍｉｎ。无菌条件下分离股骨、肱骨、胫骨 ,清除骨表面的软组织和骨骺 ,放入培养液 (含ＤＭＥＭ ,2 5ｍｍｏｌ/ＬＨＥＰＥＳ ,15 %胎牛血清 ,青霉素 10 0Ｕ/ｍｌ,链霉素 10 0ｍｇ/Ｌ ,ｐＨ 7 0 )。骨干纵行剖开 ,吸管反复冲洗骨髓腔 ,静止 1ｍｉｎ。取 2 4孔培养板 ,每孔加 1ｍｌ培养液和一个骨磨片或盖玻片 ,37℃、5 %ＣＯ2 孵育箱 1ｈ。吸出培…     

大鼠长骨成骨细胞体外培养形态观察

目的 建立生长期大鼠长骨成骨细胞体外培养实验模型并观察其生长及骨化过程。方法 以10周龄Wistar大鼠股骨，胫骨为材料，采用酶分次消化法分离成骨细胞，经DME：F－12加10％胎牛血清的培养基原代和传统培养或含50μg/ml L-抗坏血酸和10mmol/L β－甘油磷酸钠的培养基连续培养，追踪观察成骨细胞在体外培养中的增殖及形态变化，并通过Giremsa,ALPey Kossa染色技术，观察细胞体外基质分泌和骨化过程。结果 （1）大鼠工骨成骨细胞具有体内成骨细胞的形态特征，增殖代谢旺盛，其群体倍增时间为78h。（2）成骨细胞分泌形成球形和无定形基质。（3）当给予钙化条件培养时，细胞形成钙化骨基质。（4）大多数细胞ALP染色呈阳性并与基质的钙化密切相关。结论 培养的生长期大鼠长骨成骨细胞具有成骨细胞的某些生物学行为，为儿童骨生长及调控的研究提供了一种实验模型。     

IL-11与成骨细胞和破骨细胞的关系研究进展

<正>成骨细胞成骨和破骨细胞骨吸收在骨代谢平衡中起着重要作用。骨形成和骨吸收之间的失衡会导致多种疾病,如原发性骨质疏松症、风湿性关节炎等。成骨细胞和破骨细胞受多种因素调控:全身因素[如甲状旁腺素(PTH)、1,25(OH)_2D_3、降钙素、性激素等]骨局部因子[如白介素1,4,6,11,18、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子β(TGF_β)等]和遗传因素(如维生素D受体基因多态性、胶原基因变异、胶原酶基因变异等)。近年来的研究表明,许多全身性激素对骨代谢的影响需要骨局部因子参与或介导,因此骨局部因子在成骨细胞和破骨细胞生长、代谢方面起着十分重要的调控作用。IL-11是新近发现对成骨细胞和破骨细胞有重要作用的细胞因子。     

氟化物对体外乳鼠颅盖骨分离细胞活力的影响

目的：建立较成熟的体外成骨细胞培养鉴定技术,初步观察氟化物对体外乳鼠颅盖骨分离细胞活力的影响。方法：采用颅盖骨分离细胞体外培养、传代、鉴定及MTT比色法。结果：染氟110.5mg/L时细胞活力明显降低;染氟44.2mg/L、110.5mg/L 120h对细胞活力有抑制作用,表明高剂量氟能抑制细胞增殖;而染氟8.84mg/L 120h,氟刺激细胞活力增强。结论：高剂量氟能抑制细胞增殖,表明培养时间较长时,方能显示低剂量对细胞增殖的促进作用。     

氟化物对体外乳鼠颅盖骨分离细胞活力的影响

目的 :建立较成熟的体外成骨细胞培养鉴定技术 ,初步观察氟化物对体外乳鼠颅盖骨分离细胞活力的影响。方法 :采用颅盖骨分离细胞体外培养、传代、鉴定及 MTT比色法。结果 :染氟110 .5 mg/L时细胞活力明显降低 ;染氟 4 4 .2 mg/L、110 .5 mg/L 12 0 h对细胞活力有抑制作用 ,表明高剂量氟能抑制细胞增殖 ;而染氟 8.84 mg/L 12 0 h,氟刺激细胞活力增强。结论 :高剂量氟能抑制细胞增殖 ,表明培养时间较长时 ,方能显示低剂量对细胞增殖的促进作用。     

胎鼠神经干细胞分离培养和鉴定

目的:建立胎鼠神经干细胞体外培养方法,观察神经干细胞生长特点。方法:采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的无血清培养基对大鼠胚胎大脑组织细胞悬液进行培养,细胞免疫荧光方法对神经干细胞鉴定,MTT法测定不同细胞密度的OD值,绘制生长曲线。结果:从胎鼠脑组织分离培养的细胞巢蛋白阳性。MTT结果显示细胞接种密度以2(×104～105)/ml生长良好(r=0.95,P<0.05)。结论:无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫鉴定为神经干细胞。     

乳鼠成骨细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的 探讨建立乳鼠成骨细胞体外培养方法 的可行性及成骨细胞的生物学特性.方法 取出生后24h内乳鼠颅盖骨,采用多次复合胶原酶消化法进行消化及体外培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,进行成骨细胞HE染色,碱性磷酸酶染色,基质钙结节染色及Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色,对大鼠成骨细胞进行鉴定.结果 所培养细胞为成骨细胞,并生长良好,HE、碱性磷酸酶染色,钙结节染色及Ⅰ型胶原蛋白染色均阳性.结论 采用复合胶原酶消化法分离培养的成骨细胞具有典型成骨细胞生物学特性,且成分较单一.     

染料木素对体外培养胎鼠海马神经元细胞活力及其形态的影响

目的:观察染料木素(Genistein,Gen)对正常胎鼠海马神经元细胞培养条件下的活力及其形态影响。方法:取16～18d孕龄SD胎鼠海马组织进行原代培养海马神经元。采用MTT比色法检测0.01μg/ml、0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml、5.12μg/mlGen组及空白组对海马神经元分别作用24h、48h、72h的细胞活力及其形态变化。结果:1Gen对海马神经元细胞活力的最佳剂量为0.32μg/ml;Gen在0.01μg/ml、0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml呈剂量依赖性增强;而0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml、5.12μg/mlGen各组的细胞活性呈剂量依赖性下降。2Gen各剂量度组对海马神经元细胞的最明显促进生长时间是24h;Gen作用48h和72h时细胞活力则呈下降趋势。30.32μg/mlGen干预24h海马神经元细胞的形态最佳;0.01μg/ml、0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/mlGen各组随剂量的增加对海马神经元细胞的生长促进作用明显增强,细胞形态呈轴突树突明显连接成网,胞体折光性好,细胞碎片少;大于0.32μg/mlGen剂量的效应结果则反之,随剂量增大其作用明显呈副效应变化,其细胞形态的轴突树突网状结构不明显,胞体折光性差,且呈崩解趋势,细胞碎片明显增。结论:Gen对体外培养胎鼠海马神经元细胞生长活力作用的最佳剂量为0.32μg/ml,最佳效应时间是24h。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞，体外培养、扩增，观察细胞的大体形态和超微结构；通过绘制细胞生长曲线、MTT实验来研究细胞的增殖能力争代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形。胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体，具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便，能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。     

骨巨细胞瘤中的多核巨细胞体外骨吸收研究

目的：比较破骨细胞与骨巨细胞瘤中多核巨细胞的特点，明确后者的性质和来源。方法：用倒置相差显微镜观察体外培养的多核巨细胞的一般形态及降钙素对它的影响；用骨片与多核巨细胞共同培养法观察多核巨细胞的体外骨吸收功能，用扫描电镜观察骨吸收陷窝，Ｇｏｍｏｒｉ染色观察多核巨细胞的酸性磷酸酶活性。结果：倒置相差显微镜下可见多核巨细胞胞核较多（２０个以上），胞浆周边不规则，有伪足样突起；胞浆内可见较多大小不等的空泡；降钙素（１００μｇ·Ｌ－１）可抑制多核巨细胞的伪足样运动；多核巨细胞与灭活的骨片共同培养时可见骨吸收陷窝形成，扫描电镜下可见吸收陷窝底面有原纤维；Ｇｏｍｏｒｉ染色时可见多核巨细胞的酸性磷酸酶呈阳性。结论：证实了多核巨细胞具有破骨细胞的形态特征与骨吸收功能，可能来源于骨髓的破骨细胞前体细胞     

胚胎大鼠脊髓运动神经元体外培养方法的优化

目的建立一种胚胎大鼠脊髓运动神经元的体外分离培养方法。方法采用原代培养的方法,从孕15天胚胎大鼠的脊髓腹侧组织中分离脊髓前角神经元,通过差速贴壁法纯化培养细胞,应用神经元特异性的烯醇化酶抗体和抗神经微丝抗体-SMI32单克隆抗体对培养细胞进行鉴定。结果纯化培养体系中神经元占培养细胞的90％以上,其中70％左右为脊髓运动神经元(spina lmotor neurons,SMNS)。结论通过差速贴壁法纯化分离培养的SMNS体外生长状态良好,纯度高,可作为神经科学领域的重要研究手段。     

成体大鼠的骨髓间充质干细胞分离和体外培养的初步研究

目的：探讨成体大鼠的骨髓间充质干细胞（MSCs)的分离，体外培养，为其应用提供实验依据，方法：无菌条件下抽取大鼠股骨骨髓，Percoll梯度分离液离心分离，在含12％生牛血清的DMEM中，37％，5％，CO2饱和湿度下常规培养，对分离的细胞行碱性磷酸酶（AKP）的检测，结果：取较高纯度的成体大鼠骨髓MSCs，并保持细胞的活性，成体大鼠骨髓MSCs在体外培养中，为贴壁生长的单个核球形细胞，培养3－4d后开始大量增殖，并形成形态均一的细胞增殖集落。对分离后所获细胞进行AKP染色为强阳性。结论：采用Percoll梯度分离液进行分离心分离，可获得较高的MSCs，是实用，便捷的可行的方法，而且在体外培养的条件下能大量增殖，形成态均一的细胞集落，可以成为进一步进行细胞扩增或其它实际应用的基础。     

体外分离大鼠骨髓间充质干细胞方法研究

目的确定分离骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)过程中的各种条件对获得MSCs群的影响。方法应用不同的分离液、离心温度、速度、培养液及不同品种胎牛血清等条件分离培养细胞并进行对比分析。结果使用 2种分离液 ,在相同离散密度时 ,得到的细胞群相同 ;相同离散密度的 2种分离液 ,不同离心温度、速度及时间 ,如果培养条件相同 ,获得的细胞群也相同 ;用含国产或进口胎牛血清的培养基进行培养所获细胞有明显的不同 ;改良的最小必需培养基 (Dulbecco′sminimumessentialmedium ,DMEM )中添加F12与不添加F12获得的细胞克隆群基本相同。结论无论使用那种分离液 ,只要其离散密度在 10 73g/L均能获得较纯的MSCs;在确定温度、时间、速度等条件下 ,确定基础培养基、选择合适的胎牛血清是取得实验成功的关键。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离、体外培养和向软骨细胞表型定向分化的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取大鼠四肢骨髓,Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法得到MSCs,在含15％FBS的低糖DMEM培养液中,置于37C,5％CO2培养箱内培养10～14d。传代后以15％FBS的高糖DMEM培养液(含TGF-β110μg／L,地塞米松10^-7mol／L,维生素C50mg／L)对其进行诱导培养。观测在体外培养条件下MSCs的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况。结果：①分离获取了较高纯度的MSCs,保持了细胞的活性;②MSC5原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈长梭形;传代培养中形态特性无明显变化,细胞增殖周期缩短,细胞均质性明显提高;⑧诱导后的细胞由梭形向多角形转变,Ⅱ型胶原免疫组化阳性。结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的MSCs;②MSCs在体外培养条件下能大量增殖。通过离体培养,可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增;③MSCs在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化,并能分泌软骨特异性基质,可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的：研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法：用HGF、aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT—PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果：除对照组外其余各组细胞均有AFP表达（P〈0．05）;对照组及a＋O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达（P〈0．05）。结论：HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

骨巨细胞瘤体外培养及其生物学特性的观察

１９８３～１９９２年作者通过组织培养，组化及免疫组化、电镜、细胞遗传学，动物接种等方法，对骨巨细胞瘤（ＧＣＴ）的生物学特性进行研究，认为ＧＣＴ的基质细胞有两种，即间叶性基质细胞及巨噬细胞性基质细胞，巨噬细胞性基质细胞可能为许多种不同的巨噬细胞混合体，这两种类型细胞在瘤组织内互相依赖存活。在体外培养见巨噬细胞性基质细胞逐渐减少而消亡，间叶性基质细胞则在没有巨噬细胞性基质细胞的情况下也容易老化及消亡，故目前尚未有本瘤的细胞株建立。多核巨细胞是一反应性及终末性细胞，可能由于基质细胞分泌目前尚末清楚的细胞因子，吸引血中破骨细胞前身的单核巨噬细胞到瘤组织内，并促进其分化成破骨细胞样多核巨细胞。     

体外培养人眼小梁细胞吞噬乳胶微粒观察

应用体外培养的人小梁细胞,观察其吞噬乳胶微粒的能力。结果显示吞噬过程开始４小时内,吞噬功能随时间延长而增强;但吞噬过久细胞则出现变性或死亡。电镜示吞噬微粒后的细胞呈“激惹”状态。结合小梁细胞功能,对吞噬过程的重要性进行了讨论。     

培养自体骨髓基质细胞移植修复骨缺损的实验研究

目的：研究体外培养的骨髓基质细胞对骨缺损修复的作用。方法：从实验用新西兰大白兔股骨大转子处抽取2ml骨髓制成细胞悬液,体外培养14d。在双侧桡骨处形成1．5cm长的骨膜骨缺损。再将培养14d的骨髓基质细胞注射到一侧桡骨缺损处,另一侧桡骨缺损处注射培养液作为对照侧。移植后1、2、3、4周末．用X线分别检查双侧桡骨缺损处．摄X线侧位片。取第4周末的骨痂进行组织学检查。结果：移植后第2、3、4周末．实验侧骨痂形成明显快于对照侧,第4周末．实验侧的骨痂中已形成骨性骨小梁．为骨性骨痂。结论：体外培养的骨髓基质细胞可以促进骨缺损的修复。