姜黄素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的影响及分子机制

目的 研究姜黄素对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症因子表达的影响,初步探讨可能的分子机制.方法 使用LPS(1μg)和姜黄素(5μmol/L、15μmol/L或30μmol/L)处理HUVEC细胞24 h,收集细胞总RNA,实时定量PCR(RT-PCR)和ELISA方法检测细胞TNF-α、MCP-1水平;Western blot检测细胞TLR4、MAPKs、NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκBα的表达情况.结果 与空白对照组比较,姜黄素能显著抑制LPS诱导HUVEC细胞TNF-α、MCP-1和TLR4的过表达(P<0.05),明显降低NF-κB p65和MAPKs的磷酸化及IκBα蛋白降解(P<0.05).结论 姜黄素可能基于抑制TLR4/NF-κB,从而影响LPS诱导HUVEC细胞炎症因子的表达.     

双氢青蒿素抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应

目的 观察双氢青蒿素(dih ydroartemisinin,DHA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症反应的影响及其机制.方法 LPS诱导BV-2小胶质细胞活化建立炎症模型,用不同浓度DHA(0.5、1、2、4μmol/L)处理细胞,CCK-8检测细胞活性;选取lμmol/L DHA干预细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;RT-PCR检测iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平;ELISA检测培养基中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平;Western blot检测NF-κB、IκBα及TLR4的蛋白表达.结果 低剂量的DHA(＜2μmol/L)对BV-2细胞活性无明显影响(P＞0.05),DHA可抑制LPS引起的BV-2细胞形态变化,DHA抑制活化的BV-2细胞iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达(P＜0.01),减少IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子释放(P＜0.01),明显降低TLR4的蛋白表达,减少细胞质内IκBα的表达,并抑制NF-κB向核内移位(P＜0.01).结论 DHA可能通过作用于TLR4/NF-κB通路,抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞NF-κB的激活,从而抑制炎症因子的产生,发挥抗炎作用.     

大黄素对脂多糖诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响

目的 观察大黄素对脂多糖(LPS)诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响.方法 原代培养角膜基质细胞,选取第4代细胞进行实验.根据在LPS刺激角膜基质细胞前是否先用40μmol/L大黄素培养细胞30min,将细胞分为大黄素+LPS组和LPS组,分别在10μg/L LPS刺激角膜基质细胞前以及刺激后1、2、4、8 h收集细胞;或先用0、5、10、20和40 μmol/L的大黄素培养细胞30 min后,再用10μg/L LPS刺激8 h.Western blot检测角膜基质细胞κB抑制因子-α(IκB-α)蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测角膜基质细胞白细胞介素(IL)-6和IL-8的mR-NA表达.结果 LPS刺激角膜基质细胞后1、2、4、8h,细胞表达IκB-α蛋白均较刺激前明显下降(P<0.01);大黄素对LPS引起的角膜基质细胞IκB-α蛋白的降解有不同程度的抑制作用,且该作用呈一定的浓度依赖性(P<0.05).LPS刺激引起角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达升高,刺激后各时间点IL-6和IL-8 mRNA表达均较LPS刺激前明显升高,呈一定时间依赖性(P<0.01);大黄素对LPS诱导的角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达有明显抑制作用,且该作用呈一定浓度依赖性(P<0.05).结论 大黄素能抑制体外培养的角膜基质细胞表达IL-6和IL-8,可能与其抑制IκB-α降解、促进NF-kB活化有关.     

白藜芦醇对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞炎症反应的干预作用

【目的】探讨白藜芦醇对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人支气管上皮细胞炎症反应的干预作用及可能机制。【方法】培养人支气管上皮细胞16-HBE。实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测TNF-α诱导的16-HBE细胞中白细胞介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、白细胞介素1β(IL-1β)mRNA的表达水平及白藜芦醇对其预处理后的变化;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测白藜芦醇预处理TNF-α诱导的16-HBE细胞后其核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)和磷酸化核转录因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)及核转录因子κB p65(NF-κB p65)和磷酸化核转录因子κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白表达水平。【结果】与空白对照组比较,10 ng/mL TNF-α诱导24 h可明显诱导16-HBE细胞中IL-6、MMP-9、IL-1βmRNA表达上调(P 0.01或P 0.001)。与TNF-α诱导组比较,50、100、150μmol/L白藜芦醇预处理的TNF-α诱导16-HBE细胞中IL-6、MMP-9、IL-1βmRNA表达水平均降低(P 0.001),且呈剂量依赖性。与TNF-α诱导组比较,50、100、150μmol/L白藜芦醇组TNF-α诱导的16-HBE细胞中p-IκBα蛋白表达水平增高,且呈剂量依赖性,其中,100、150μmol/L白藜芦醇组差异有统计学意义(P 0.01或P 0.001),而p-NF-κB p65蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P 0.001)。【结论】白藜芦醇可能通过调控NF-κB信号通路抑制TNF-α诱导的人支气管上皮细胞炎症反应。     

H2S对氧化型低密度脂蛋白诱导人单核巨噬细胞核转录因子-κB的影响及机制

目的:研究硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人单核巨噬细胞NF-κB通路的调节作用及其机制。方法:人单核细胞系THP-1细胞采用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)诱导分化为巨噬细胞后,分为4组:对照组、ox-LDL组、ox-LDL+H2S100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组。用Western blot检测细胞IκBα蛋白表达及NF-κB磷酸化水平,激光共聚焦法检测细胞胞浆IκBα及NF-κB的核转位改变,免疫共沉淀方法检测细胞核中NF-κB p65与IκBα结合情况。结果:Western blot结果显示,与对照组相比,ox-LDL组人单核巨噬细胞中NF-κB p65磷酸化水平明显升高(0.855±0.116 vs.0.502±0.218,P=0.046),IκBα表达明显减少(0.612±0.216 vs.0.997±0.167,P=0.029);与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞中NF-κB p65磷酸化水平显著降低(0.424±0.225 vs.0.855±0.116,P=0.020;0.378±0.071 vs.0.855±0.116,P=0.011),IκBα表达显著增多(1.037±0.111 vs.0.612±0.216,P=0.015;1.046±0.084 vs.0.612±0.216,P=0.013)。激光共聚焦结果显示:与对照组相比,ox-LDL组THP-1源性巨噬细胞胞浆中IκBα表达明显降低,NF-κB p65核转位明显增加;与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞胞浆IκBα表达显著增多,NF-κBp65核转位明显减少。免疫共沉淀结果显示,对照组人单核巨噬细胞胞核内未检测到NF-κB p65与IκBα的结合,ox-LDL组细胞核内NF-κB p65与IκBα结合较少,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞核内NF-κB与IκBα结合明显增多。结论:H2S可抑制ox-LDL诱导人单核巨噬细胞中NF-κB通路激活,其作用机制可能与抑制胞浆中IκBα降解,减少NF-κB p65磷酸化激活及核转位,同时可促进胞核中IκBα与NF-κB的结合,进而抑制NF-κB的活性有关。     

参附注射液对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞核因子-κB的激活和细胞因子产生的影响

目的 研究脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞核因子-κB(NF-κB)的激活和细胞因子的释放以及参附注射液(SF)的干预作用,进一步探讨SF对肺脏保护机制.方法 通过支气管肺泡灌洗获取大鼠肺泡巨噬细胞(Ams).对获取的Ams进行LPS刺激(10 ng/ml,2 h)或预先用SF(5 μl/ml,10 μl/ml)孵育30 min,然后加入LPS(10 ng/ml)分别刺激2 h.用RT-PCR法检测Ams中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因表达水平.ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-8的水平.Western blot法检测Ams中NF-κB抑制蛋白-α(IκBα)和NF-κB的水平.结果 LPS能够增加Ams中TNF-α mRNA表达水平和培养上清中TNF-α和IL-8的水平.同时LPS促进了IκBα的降解,诱导了NF-κB的激活.与LPS组比较,SF能够减少Ams中TNF-α mRNA表达水平和培养上清中TNF-α和IL-8的水平;抑制LPS诱导的IκBα的降解和NF-κB的激活.结论 SF通过抑制Ams中IκBα的降解,减少了NF-κB的激活,从而减少了LPS诱导的大鼠Ams细胞因子的产生.     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

黄芩苷对脂多糖诱导人牙龈成纤维细胞表达炎症因子的影响

  目的  从PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(HGFs)损伤的影响及机制。  方法  运用LPS诱导建立人牙龈成纤维细胞损伤模型,设置正常对照组、模型组和模型+黄芩苷(1、10和20μg/mL)组,每组设3个复孔,经不同浓度的黄芩苷干预后,Western blotting检测p-Akt、Akt、NF-κB p65等蛋白的表达,采用qPCR法检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等基因的表达。用PI3K抑制剂LY294002作用半小时后,再用黄芩苷干预,qPCR和Western blotting法检测Akt、p-Akt、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6等基因和蛋白的表达。  结果  与模型组比较,黄芩苷低、中、高剂量能有效降低TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平,促进p-Akt蛋白表达,抑制NF-κB p65核蛋白表达,并呈剂量依赖性(均P < 0.05)。与模型组比较,模型+黄芩苷组p-Akt表达升高(P＜0.05),NF-κB p65表达降低(P＜0.01)。PI3K抑制剂LY294002作用后,模型+黄芩苷组p-Akt/Akt表达量(0.63±0.18)较模型组(0.56±0.14)升高(P＜0.05),模型+黄芩苷组NF-κB p65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达量较模型组降低(均P＜0.01)。黄芩苷对LY294002作用后,p-Akt/Akt、NF-κB p65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达量与模型组比较,差异无统计学意义。  结论  黄芩苷可抑制LPS诱导的人牙龈成纤维细胞损伤引起的炎症反应,其作用机制可能与促进Akt的磷酸化,抑制NF-κB p65核转录和炎性因子的释放有关。      

氯喹对脂多糖/内毒素诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88非依赖信号转导途径的抑制作用

目的探讨氯喹对脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)诱导TLR4-MyD88非依赖途径的抑制作用。方法MTT法检测不同浓度氯喹(5、10、20、40、60μg/ml)对RAW264.7细胞活性的影响,ELISA检测培养体系中TNF-α、IL-6在2、6、12、18、24h的释放情况,RT-PCR检测TNF-α、IL-6、TLR4、TRAMmRNA的表达,EMSA检测NF-κB的活性,Westernblot检测IκBα磷酸化水平和IRF3的降解情况。结果氯喹浓度小于40μg/ml时对RAW264.7细胞活性无影响(P0.05);应用氯喹预处理后LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6在蛋白水平和核酸水平均受到明显抑制(P0.05),TLR4和TRAM在核酸水平均受到显著抑制(P0.01);EMSA结果显示NF-κB的活化受到抑制,而Western blot检测显示IκBα磷酸化及IRF3的降解也受到抑制。结论氯喹对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88非依赖信号转导途径具有抑制作用。     

NALP3及NF-κB信号通路在氧化应激反应中的作用及阿魏酸钠的干预效应

目的 检测氧化应激时人肺上皮细胞（A549）炎性复合体NALP3、核转录因子-kappa B （NF-κB）基因和蛋白的表达,探讨阿魏酸钠对其的干预作用及可能的作用机制。方法 培养A549细胞,分为对照组、 H2O2（100 μmol/L）应激组、NF-κB阻断剂组（PDTC + H2O2组）、阿魏酸钠干预组（阿魏酸钠+H2O2组）,其中PDTC(100 μmol/L)和阿魏酸钠（400 μg/mL）预处理30 min后加入H2O2（100 μmol/L）,培养2 h后,采用实时荧光定量-PCR （qRT-PCR）检测NALP3、NF-κB（P65） mRNA的表达; Western blot检测NALP3、IκBα蛋白的表达;酶联免疫吸附（ELISA）测定细胞上清中白介素-1β（IL-1β）的表达。结果 与对照组比较,H2O2 可使A549细胞NALP3 mRNA、NALP3蛋白水平表达增强,NF-κB（P65） mRNA表达上调、IκBα降解增强,IL-1β分泌增加（P均<0.05）;而阿魏酸钠及NF-κB阻断剂PDTC可抵抗H2O2对A549细胞的作用,与H2O2应激组比较,下调NALP3 mRNA、NALP3蛋白、NALP3、NF-κB（P65） mRNA表达,IκBα降解减少,IL-1β分泌下降（P均<0.05）,并且阿魏酸钠与NF-κB阻断剂PDTC上述作用差异无统计学意义。结论 阿魏酸钠可能通过抑制NF-κB的活化,减少NALP3及IL-1β的表达,从而减轻氧化应激导致的炎症反应。