重组幽门螺杆菌热休克蛋白A的纯化研究

目的对重组幽门螺杆菌热休克蛋白A大肠杆菌工程菌表达的rHspA蛋白进行纯化研究。方法酵后的重组大肠杆菌进行高压破菌后,采用镍离子亲和柱层析和凝胶过滤柱层析相结合的方法分离纯化rHspA,使用SDS-PAGE和HPLC鉴定蛋白纯度,注射免疫家兔检测纯化后的rHspA的免疫学活性。结果所纯化获得的rHspA蛋白纯度>98%,总回收率为60%,并且保持了良好的免疫学活性。结论建立了从重组大肠杆菌中纯化高纯度rHspA的工艺,为Hp疫苗的进一步研究提供了材料。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的　对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法　应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果　PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论　所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。     

重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达及其功能研究

目的：建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段（rGPIbαH1-V289）细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能.方法：利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289 的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞.用亲和层析法纯化重组片段.用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性.用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响.用ELISA测定纯化产品对vWF与血小板结合能力的影响.结果：每1 L培养上清液可纯化到6.15 mg rGPIbαH1-V289重组产品.SDS-PAGE显示,纯化的重组片段主要在42 kD处显一蛋白区带,Western blot显示,抗GPIbα单抗SZ-2能与重组片段在42 kD处显单一蛋白区带.纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能.ELISA测定显示纯化产品抑制血浆vWF与血小板的结合能力.结论：CHO细胞株A1能恒定表达rGPIbαH1-V289,重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性,有可能开发为有效的抗血栓药物.     

幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的 构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定.方法 采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b( )-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和western blotting、ELISA检测、GM1活性检测.结果 成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b( )-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b( )-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97 %,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合.结论 Hp HpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性.为新一代Hp疫苗的研制奠定基础.     

SARS冠状病毒N蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的 获得重组SARS冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白抗原，建立特异性诊断SAILS病毒感染的免疫学方法。方法 大肠埃希菌中表达SARS病毒N蛋白基因，用金属螯合层析纯化N蛋白，建立检测SARS抗体的EUSA方法。结果 大肠埃希菌中表达了SARS病毒全长N蛋白抗原，经包涵体洗涤和金属螯和纯化后得到纯度较高的重组蛋白。用重组抗原EUSA检测30名SARS患者抗体全部为阳性，30名正常人血清为阴性，30名发热非SARS患者血清为阴性。结论 SARS表达核蛋白可以在大肠埃希菌中得到高效表达，纯化的重组N蛋白具有良好抗原性，可用于检测SARS抗体。     

利用新型表达载体一步获得HIV-1核壳蛋白p24纯品

目的 利用新型原核表达载体获得人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核壳蛋白p24纯品。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出HIV-1 HXB2株gag开放阅读框架的内壳蛋白p24的基因片段，将目的基因片段插入到新型表达载体pTXB中构建成重组表达质粒pTXB-p24。表达产物的纯品通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切而得到。用SDS-PAGE和HPLC分析所得纯品的大小和纯度，用Western blot和胶体金实验检测其抗原性。结果 构建的重组表达质粒pTXB-p24经IPTG诱导得到C端融合Intein-CBD的p24蛋白，该蛋白通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切得到纯化的非融合的p24重组蛋白。HPLC分析表明其纯度可达96％，胶体金结果显示纯化的p24可与HIV-1阳性患者的血清反应，具良好的抗原性。结论 利用新型原核表达载体可一步获得纯度为96％的非融合p24抗原纯品，为大规模生产该蛋白提供了可靠的保证。     

EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸(6 X His)的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.     

EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸(6 X His)的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.     

EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

目的 应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法 利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸（6 X His）的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论 利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.     

重组人白细胞介素21的制备及免疫学活性分析

目的:纯化制备rhlL-21,并分析其免疫学活性.方法:在含重组质粒pGEX4T-2/IL-21的大肠杆菌DH5a中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度.用MTT法研究rhIL-21对T细胞增殖、NK细胞杀伤活性的影响.结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhIL-21纯度达95%.rhIL-21能促进T细胞增殖,能增强NK细胞杀伤活性.结论:成功制备了rhIL-21,其在体外具有一定的免疫学活性,为其大量制备和体内的生物学活性研究奠定了基础.     

粉尘螨变应原第7 组分( Der f 7) 重组蛋白单克隆抗体的制备

目的:克隆表达粉尘螨变应原第7 组分(简称Der f 7)重组蛋白,制备抗Der f 7 单克隆抗体,并进行鉴定。方法:用pET28a(+)-Der f 7 原核表达体系表达Der f 7 重组蛋白,以此免疫BALB/ c 小鼠,将骨髓瘤细胞和脾细胞融合,经ELISA法筛选杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔,获得腹水,经蛋白A 琼脂糖介质纯化,后鉴定抗体的效价、纯度,采用免疫印迹法鉴定抗体的特异性。结果:获得三株稳定分泌重组Der f 7 单克隆抗体的杂交瘤细胞,产生的抗体纯度高,效价高于1 ：243 000。Western blot 显示能很好地识别Der f 7 重组蛋白。为Der f 7 变应原的定量、定位及相关过敏性疾病的诊疗奠定基础。结论:成功获得粉尘螨变应原第7 组分(Der f7)重组蛋白单克隆抗体,且抗体效价纯度及特异性较好。     

2型猪链球菌胞壁蛋白MRP的截短表达、纯化及抗原保护性评价

目的:扩增猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)05Z33中的mrp基因,并在大肠杆菌BL21中重组表达,以获得高纯度的重组MRP截短蛋白,验证其抗原保护性。方法:以05ZYH33基因组为模板并设计引物扩增目的片段,构建表达质粒,利用亲和层析对目的蛋白进行纯化,免疫新西兰大白兔制备抗血清并测其效价。通过抗原保护实验及抗血清调理的全血杀伤实验验证重组MRP蛋白抗原保护性。结果:重组MRP蛋白在大肠杆菌中高浓度表达,纯化获得了高纯度的MRP截短蛋白并制备获得了抗血清。经该蛋白免疫过的CD-1小鼠与阴性对照组相比,存活率显著升高。经抗血清调理后,野生株05ZYH33在全血中的存活率显著降低,突变株ΔMRP无显著变化。结论:MRP蛋白有较高的抗原保护性。     

CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

探索ＧＰＩ－锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离ＣＤ５９分子。方法通过ＰＣＲ选择性扩增编码成熟ＣＤ５９氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入ＰｉｎＰｏｉｎｔＸａ－３质粒中。ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在丛外微量反应性溶血抑制实验中检测重组ＣＤ５９纯化样品的生物学活性。     

大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的诱导人腺苷激酶重组蛋白在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a（＋）连接构建的重组蛋白表达载体pET30a（＋）／ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞。1mmol／L的1PTG诱导重组蛋白表达。离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体。用含2mol／L和4mol／L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白。随后用含8mol／L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀。用Ni—NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8mol／L尿素的洗脱缓冲液洗脱。收集样品透析复性。结果成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85％以上的重组蛋白。结论人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化,为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。