酯酶显色法快速检测尖音库蚊对有机磷的抗性

目的开发能够快速检测野生尖音库蚊种群对有机磷杀虫剂的抗性水平及靶标抗性的试剂盒。方法根据蚊虫抗药性的生化和分子机制,通过建立不同抗性水平的品系,将经典的羧酸酯酶显色与抗性水平对应起来;根据G119S突变导致的不敏感乙酰胆碱酯酶1对不同浓度残杀威抑制的反应,建立靶标抗性与显色反应的关系。结果制备了反映不同有机磷抗性倍数的羧酸酯酶滤纸显色卡,可以快速、简便的检测野生尖音库蚊种群的有机磷抗性水平;建立了用肉眼就可辨别的乙酰胆碱酯酶显色反应体系,快速检测种群中是否存在靶标抗性及其基因型。结论为我国蚊虫抗性检测和预警工作提供了方便、简洁而有效的工具。     

中国媒介蚊虫对有机氯类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性调查

蚊虫由于其特殊的行为、生理以及与人类生活关系紧密而成为传播人类疾病的重要媒介,自20世纪化学杀虫剂广泛使用后,蚊虫就与这种环境变化协同进化,即通过生理生化多种机制产生抗药性。该文综述了自20世纪90年代以来,我国7种媒介蚊虫（尖音库蚊复组、中华按蚊、三带喙库蚊、微小按蚊、雷氏按蚊、白纹伊蚊和埃及伊蚊）对有机氯类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性调查结果。结果显示,不同地区的7种媒介蚊虫对DDT抗性水平较高,对六六六、三氯杀虫酯抗性调查较少,仅有库蚊对这2种杀虫剂抗性调查的报道,并且抗性水平较低。对氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性调查,主要是尖音库蚊复组对残杀威和巴沙的抗性调查报道,抗性水平较低。     

淡色库蚊酯酶A2探针应用于现场抗性检测的研究

目的制备淡色库蚊酯酶A2探针,应用于现场蚊虫抗性检测。方法设计酯酶A2上下游引物,5′端地高辛标记,PCR法制备DNA探针并对扩增片段测序、分子杂交检测各现场蚊虫抗性。结果单蚊基因组DNA稀释至1/20时,抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差别。应用酯酶A2探针检测各现场蚊虫,唐口种群的杂交阳性率为33%,微山种群的杂交阳性率为38%,滕州种群的杂交阳性率为56%。结论应用酯酶A2探针能够检测现场蚊虫抗性水平。该方法灵敏、可靠,为蚊虫有机磷杀虫剂抗性分子生物学检测提供了选择。     

杭州市库蚊复组抗性相关酯酶Estβ基因类型和频率及动态分布

目的 了解杭州市尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶基因类型、频率和动态分布,为蚊虫防制提供对策。方法 采用聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法进行抗性相关酯酶的基因分型,对2003-2005年杭州市自然种群库蚊酯酶基因的频率进行动态监测。同时结合酯酶淀粉凝胶电泳技术检测抗性酯酶基因表型监测。结果 连续3年用PCR-RFLP法对酯酶等位基因的分子分型结果表明,杭州市存在4种酯酶基因类型,主要存在世界范围内广泛分布的酯酶Estβ1（50％～54％）纯合型,其次是Estβ2（29％～34％）纯合型,Estβ1／B2（5％～10％）杂合型和一种新的EstβN（3．13％）纯合型等位基因型。用淀粉凝胶电泳分析2005年杭州市库蚊种群的抗性酯酶基因表型,主要是Estβ1型（61％）,其次是Estα2／β2型（12％）,Estαβ／β8型（7％）,敏感表型（29％）。结论 杭州市自然种群尖音库蚊复组存在多种抗性酯酶基因型,2003-2005年来Estβ1型为主,其次是Estα2／β2型,在2005年发现EstβN,是一个新的酯酶基因型,但是比例较低,仅占3．13％。该新的酯酶基因可否引起新的杀虫药剂的抗性,尚有待进一步的跟踪研究。扩增酯酶基因分子分型与抗性酯酶表型,也都表明了一致性。     

微量滴定板法测定蚊虫非特异性酯酶检测抗药性的研究

目的：探讨简捷灵敏的蚊虫抗药性早期测报技术。方法；以β－乙酸酯为底物，坚固蓝B盐为显色剂，用微量滴定板法测定实验室和现场单个淡色库蚊非特异性酯酶尖力。结果：实验室5个品系淡色库蚊以抗DDVP品系非特异性酯酶活力水平最高，其次为抗残杀威品系和抗DDVP降解品系，抗氯氰菊酯品系较低，与敏感品系相近；3个现场淡色库蚊种群对DDVP抗性为4．15－9．36倍，对残杀威抗性为1．02－3．18倍，其非特异性酯酶活力水平均较高。结论：微量滴定板法测定非线性特异性酯酶能够检测蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性水平。方法简单快速，结果客观准确，可重复性强，可测出抗性频率，早期发现抗性的存在；可测知抗性机制，便于制订克服抗药性的对策。     

非特异性酯酶在淡色库蚊对不同杀虫剂抗性发展中的作用

目的：探讨非特异性酯酶（Non-specific esterase）在淡色库蚊对不同杀虫剂抗性发展中的作用。方法：生物测试法，微滴定板法。结果：3个抗性品系随世代增加抗性增强NSE的活性各不相同，抗DDVP品系随世代增加抗性增高NSE活性而增强，其次为抗残杀威品系，抗氯氰菊酯品系则变化不明显，与敏感品系相接近。结论：NSE在淡色库蚊对有机磷杀虫剂的抗性中起重要作用，也是对氨基甲酸酯类杀虫剂产生抗性的机制之一，与拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性关系不大。     

杭州淡色库蚊抗性及酯酶活性测试

目的：用淀粉电泳酯酶谱区别酯酶，检测淡色库蚊成蚊个体酯酶，并结合对幼虫的生物测试结果，探讨抗性生化机制及防制对策。方法：幼虫的生物测试采用浸渍法，成虫的非特异性酯酶测试采用淀粉电泳法。结果：淡色库蚊对氯氰菊酯抗性最高，是敏感品系的12.30倍。其后顺次为敌敌畏、高效氯氰、溴氰菊酯、残杀威，仲丁威，抗性倍数分别为5.61、5.09、4.65、4.43、3.98，胺菊酯，二氯苯醚菊酯，EBT、三氯杀虫酯抗性不明显。淀粉电泳结果蚊虫个体中存在过量产生的非特异性酯酶Estβ1^1和Estα2/β2，且蚊虫的酯酶谱较为复杂，结论：淡色库蚊对氯氰菊酯产生了中等抗性，其次对敌敌辅同效氯氰，溴氰菊酯产生低抗性，宜换用药物，酯酶染色结果，存在引起有机磷抗性增高活性酯酶，酯酶谱且呈多态分布，与生物测试结果相一致，所以应减少敌敌畏的使用，注意轮换用药。     

山东省淡色库蚊对化学杀虫剂的抗性及防治对策

目的了解山东省淡色库蚊对常用化学杀虫剂的抗性状况,为合理有效地进行蚊虫化学防治提供依据。方法采用WHO生物测定方法,测定淡色库蚊敏感品系和现场种群对5种杀虫剂的抗性。结果 6个现场淡色库蚊种群对DDT、DDVP、马拉硫磷、残杀威、溴氰菊酯的抗性指数分别为1.59～28.48、2.22～15.72、2.36～5.50、3.40～6.33、8.50～36.00倍。结论山东省淡色库蚊对5种常用化学杀虫剂均产生不同程度的抗药性,应采取适当措施克服或延缓蚊虫抗药性的产生和发展。     

淡色库蚊三种抗性品系抗性发展与乙酰胆碱酯酶相关性的研究

目的探讨抗DDVP、抗残杀威、抗氯氰菊酯品系淡色库蚊的抗药性生物测定水平与乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，ACHE）活性的相关性。方法采用WHO生物测试法和微量滴定板法。结果在43个世代选育过程中，抗DDVP、抗残杀威、抗氯氰菊酯3种抗性品系抗性指数随世代的增加而增高，而AChE活性及敏感性在3种抗性品系中，抗残杀威品系AChE的平均抑制率随着世代的增加抗性增高程度逐渐变低，其次为抗DDVP品系。而抑制率〈30％的蚊虫抗性个体频率随着世代的增加抗性增高而增高，以抗残杀威品系最高，其次为抗DDVP品系，呈正相关关系。与生物测试法基本一致。而抗氯氰菊酯品系与敏感品系相类似。结论AChE活性在淡色库蚊与氨基甲酸酯类及有机磷杀虫剂的生测抗性水平具有相关性，与拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性关系不大。     

非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性关系的研究

目的探讨非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性的关系,为应用生物化学方法检测蚊虫抗药性提供依据。方法测定敏感（S）、抗DDVP（Rd）、抗残杀威（Rp）、抗氯氰菊酯（Rc）品系淡色库蚊及其恢复品系（Rd降解、Rp降解、Rc降解）淡色库蚊的抗药性水平和NSE活性水平。结果Rd、Rp、Rd降解、Rp降解品系淡色库蚊的抗药性系数分别为12.17、11.21、6.10、8.38,其NSE活性OD值≥1.0的个体频率分别为95.10%、52.77%、57.33%、40.28%;Rc、Rc降解品系淡色库蚊的抗药性系数分别为534.31、83.26,而其NSE活性OD值≥1.0的个体频率分别为8.75%、8.33%,均与S品系的8.25%相近。结论淡色库蚊对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性变化伴随其NSE活性的变化,而对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性变化不伴随其NSE活性的变化。测定NSE可用来判断蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性状况。     

Amplified esterases B1 and A2-B2 in field populations of Culex pipiens from China

The main organophosphate (OP) resistance mechanism in the Culex pipiens complex is increased activity of esterases A and B. Fourth-stage larvae from 2 field populations of C. pipiens from Gaomi and Kunming, China, were compared for tolerance to parathion, dichlorovos (OP), and bassa (carbamate) insecticides. Both populations were resistant to OPs but not to bassa. Starch gel electrophoresis indicated that elevated esterase activity was correlated with OP resistance. High frequencies of amplified esterase genes B1 and A2-B2 (0.85 and 0.50) were discovered in Gaomi and Kunming, respectively. However, only low levels of gene amplification were detected.     

江苏地区尖音库蚊复合组种群组成调查分析

目的了解江苏地区尖音库蚊复合组种群构成,为进一步防控蚊虫蚊媒病奠定基础。方法于2012年采集江苏省连云港、常熟、张家港、盐城、泰州、徐州、南京、南通和无锡9个地区蚊虫,通过扩增mtDNA—COI基因、测序和基因比对,对上述地区尖音库蚊复合组进行分析。结果mtDNA—COI基因分析显示,江苏地区的尖音库蚊复合组差异明显,进化树显示分为2支,南京、泰州、无锡、盐城、徐州地区为一支,与淡色库蚊同源性较高;连云港、南通、常熟、张家港地区为1支,与致倦库蚊同源性较高。结论江苏地区尖音库蚊复合组存在淡色库蚊和致倦库蚊两类基因型,未发现尖音库蚊和骚扰库蚊基因型,亦未发现新的隐藏种。     

Molecular and electron microscopic identification of Wolbachia in Culex pipiens complex populations from the Upper Rhine Valley, Germany, and Cebu City, Philippines

We detected Wolbachia infections in Culex pipiens complex mosquitoes from the Upper Rhine Valley, Germany, and Cebu City, Philippines, with the use of polymerase chain reaction (PCR) amplification of the 16S rDNA of the bacteria and further confirmation by electron microscopy. Species of 5 different autogenous and anautogenous populations of Culex pipiens from Germany and 1 population of Culex quinquefasciatus from the Philippines were used in this study. Larvae were sampled from different localities and reared to the adult stage for further processing. Whole adult males and the heads of adult females were processed by PCR, whereas the abdomens of females were used for electron microscopic study when an infection was detected by PCR. All Culex populations assayed by PCR showed infection of Wolbachia at rates between 10 and 100%. Females from different populations exhibited higher infection rates than did the males, and, likewise, Cx. pipiens populations that were autogenous showed higher infection rates of Wolbachia than did anautogenous individuals. In Cx. quinquefasciatus populations, males were infected at 33.33% and females, only 10%. We studied the ultrastructure of Wolbachia in the ovaries of species belonging to Cx. pipiens complex by means of transmission electron microscopy. The bacteria exhibited typical morphology for Wolbachia with 3 enveloping membranes.     

我国大陆尖音库蚊复组对杀虫剂抗药性的分布研究

目的掌握我国大陆尖音库蚊组蚊对主要杀虫剂抗药性地理分布,探讨应对策略和措施,为蚊虫的控制和抗药性治理提供依据。方法通过万方医学网检索国内1994-2012年公开发表的有关尖音库蚊复合组的抗药性相关的论文进行收集,数据整理使用Excel 2003,绘制统计地图使用Maplnfo7.0。结果尖音库蚊对DDT、DDVP、马拉硫磷、仲丁威、氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯达到中等抗性水平以上的比例为55.6%、82.4%、22.7%、0、41.5%、64.4%和86.7%,达到高抗性的比例为22.2%、64.7%、0、0、12.2%、40.7%和33.3%。DDVP和溴氰菊酯的高抗性区域重叠率达到45.9%。结论大部分监测地区尖音库蚊组对菊酯类和有机磷类杀虫剂产生了较高的抗药性,对氨基甲酸酯类杀虫剂较敏感。有机磷类杀虫剂和拟除虫菊酯类杀虫剂的高抗性区域有一定的重叠性,需采取综合治理的策略。     

尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因杂合型的分子特征

目的 研究自然种群尖音库蚊复组有机磷抗性相关酯酶B2基因EstB2杂合型的分子特征.方法 采集杭州市自然种群库蚊,提取单蚊DNA基因组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法进行抗性相关酯酶的基因分型.对酯酶B2基因Estβ2型蚊虫的PCR产物,进一步选用Bfm Ⅰ内切酶进行酶切,确定酯酶B2基因Estβ2纯合犁及Estβ2杂合型.本次研究共提取207只单蚊DNA,156份PCR样本阳性,阳性率75.36%(156/207).结果 在156份PCR样本阳性,酯酶B2基因Estβ2型占28.20%(44/156);对该基因型进一步分型,其中Estβ2纯合型占90.90%(30/33),EstB2杂合型占9%(3/33);Estβ2杂合型是以Estβ2和一种亚型杂合(Estβ2/Estβ2<'1>)形式存在.结论 建立了在自然种群尖音库蚊复组中酯酶B2基因分型方法,研究证明了杭州自然种群库蚊存在一种有机磷抗性相关酯酶B2基因Estβ2杂合型.     

淡色库蚊对溴氰菊酯抗性的分子生物学检测

目的建立一种可以早期检测蚊虫对拟除虫菊酯抗药性的方法。方法采用聚合酶链式反应（PCR）方法，用特异性引物对蚊虫的钠离子通道基因进行扩增。结果敏感品系中只检测出SS（敏感纯合子）型，抗性品系中检测出SS型、RS（杂合子）型和RR（抗性纯合子）型。结论PCR能够快速完成蚊虫对拟除虫菊酯抗药性的检测，为蚊虫对拟除虫菊酯抗药性的早期监测提供了快速可行的方法。     

三种淡色库蚊抗菊酯品系的生存力比较

目的 在实验条件下通过对3种拟除虫菊酯抗性品系的蚊虫选育,了解抗性发生、发展规律,为蚊、蝇的防制提供理论依据。方法 采用浸液法,分别用三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、胺菊酯对淡色库蚊进行抗性品系的选育,了解抗性发生、发展规律;分析抗性品系的种群生存力等主要生物学特征,比较3个品系的相对适合度。结果 胺菊酯不易产生抗性,在连续选育8代后抗性仅达4．66倍;三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯易产生抗性。对三氟氮氰菊酯抗性经6代的选育后达到41．8倍,对溴氰菊酯抗性经5代的选育后达到50．68倍。结论 抗性品系存在相对适合度缺陷。三氟氮氰菊酪、溴氰菊酯、胺菊酯抗性品系相对适合度分别为0．41、0．47和0．29。     

Identification and characterization of novel organophosphate detoxifying esterase alleles in the Guangzhou area of China.

In the mosquito Culex pipiens, various alleles at the Ester locus provide insecticide resistance. These resistance alleles display a heterogeneous geographical distribution, particularly in China, where they are highly diverse. A new resistance allele, Ester9, coding for the overproduced esterases A9 and B9, is characterized and compared to the known resistant allele Ester8 isolated from the same southern China sample (from Guangzhou). Both alleles provide low but significant resistance to chlorpyrifos (relative synergism ratio [RSR] > 3) and temephos (RSR = 1.4), which is consistent with the low level of gene amplification they display (15 copies for Ester9 and 4 copies for Ester8). The full genomic sequence of the allele coding A8 and A9 is presented, which allowed us to set up a polymerase chain reaction assay to specifically identify these alleles. The peculiar situation in southern China, where numerous resistance alleles coexist, is discussed in comparison with the Mediterranean situation, the only one with a similar diversity of overproduced esterases.     

上海口岸蚊虫与分种检索研究

目的了解上海口岸蚊虫种群和分布。方法灯诱法和捞勺法。结果2005—2007年间上海口岸共捕获蚊虫6属18种,其中按蚊属1种,伊蚊属3种,阿蚊属1种,库蚊属10种,曼蚊属1种,骚扰蚊属2种,背点骚扰蚊在上海首次捕获。广泛分布的有致倦库蚊、淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊和白纹伊蚊。结论致倦库蚊、淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊和白纹伊蚊是上海口岸可能骚扰人的常见蚊虫。     

抗氯氰菊酯淡色库蚊P450特异性探针的制备及应用

目的 制备淡色库蚊氯氰菊酯抗性株细胞色素P450特异性DNA探针，并用于抗性品系与敏感品系的检测。方法 简并引物PCR法制备特异性DNA探针，生物素杂交检测氯氰菊酯抗性淡色库蚊。结果 摸索得到合适的区分抗性与敏感品系的探针浓度，在该探针浓度下抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差异。结论 该方法为抗拟除虫菊酯类杀虫剂媒介昆虫基因检测的实用性研究及抗性分子生物学机制的研究打下了基础。