二乙基亚硝胺诱导肝癌小鼠肝组织胶原纤维的变化*

目的 观察胶原纤维在肝癌发生发展过程中的变化及其与癌变的关系。方法 饲养清洁健康BALB/c小鼠40只,以30 mg/ml二乙基亚硝胺（DEN）溶液作为饮用水,建立肝癌模型。在开始喂养后的0 w、4 w、8 w、12 w、16 w、20 w和24 w,各处死3只动物,对所取肝脏组织行石蜡包埋切片,采用天狼新红染色,对胶原纤维进行检查。通过Image-Pro Plus 6.0对采集的样本进行光密度积分（IOD）定量,应用SPSS 16.0软件对测得的数据进行ANOVA显著性分析和Student-Newman-Keuls检验。结果 小鼠在诱癌剂作用20 w后肝组织发生癌变;在4 w末,小鼠肝组织胶原纤维IOD为（97.610±18.640）,明显低于8 w末胶原纤维IOD水平[（377.054±63.668）,P＜0.05];在8 w末,胶原纤维IOD为（377.054±63.668）,明显低于12 w末胶原纤维IOD[（625.875±110.846）,P＜0.05];在16 w末,胶原纤维IOD为（847.289±53.473）,显著低于20 w末胶原纤维IOD[（1671.301±292.593）,P＜0.01];在20 w末,胶原纤维IOD为（1671.301±292.593）, 显著低于24 w末胶原纤维IOD[（3968.450±138.949）,P＜0.01]。结论 胶原纤维在癌变的整个过程中沉积量逐渐增加,变化明显,可能与肝组织的损伤修复和癌变的扩散密切相关。     

CCl4诱导大鼠肝硬化形成过程中Caspase-12蛋白表达与肝细胞凋亡的相关性

目的:探讨CCl4大鼠肝硬化形成过程中Caspase-12蛋白表达与肝细胞凋亡的相关性.方法:首次CCl4 3 mL/kg sc,以后500 mL/LCCl4橄榄油溶液2 mL/kg sc,2次/wk,共计12wk制备大鼠肝硬化模型.设4 wk、8 wk、12wk 3个时间点,动态观察肝细胞凋亡指数、肝组织Caspase-12免疫组织化学及蛋白表达.结果:模型大鼠4 wk时呈典型的急性肝损伤改变,8 wk时大鼠呈典型的慢性肝损伤肝纤维化的病理改变,12 wk时已形成肝硬化;随着肝损伤加重和肝硬化形成,肝细胞凋亡指数显著增加,模型对照4 wk与正常组、模型对照8wk比较有显著差异(70.4±11.59 vs 9.6±1.14,95.8±10.94,P＜0.01),模型对照12 wk与模型对照8 wk比较有统计学意义(122.8±17.51 vs 95.8±10.94,P＜0.05).Caspase-12蛋白表达亦显著增加,模型对照4 wk与正常组、模型对照8 wk比较有显著差异(0.071±0.014 vs 0.014±0.007,1.172±0.028,P＜0.01),模型对照12wk与模型对照8 wk比较亦有显著差异(1.84±0.083 vs 1.172±0.028,P＜0.01);且肝细胞凋亡指数和Caspase-12蛋白表达量之间呈正相关(r=0.89,t=9.125,P＜0.01).结论:内质网凋亡通路参与CCl4大鼠肝硬化形成过程中肝细胞凋亡事件,其关键的凋亡酶Caspase-12蛋白表达量基本能够反映肝细胞的凋亡程度.     

促凋亡蛋白Bid在肝癌发生过程中的作用

目的探讨促凋亡蛋白Bid在肝癌发生中的作用。方法应用基因毒性药物二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）制备小鼠实验性肝癌动物模型，通过阻断（Bid缺陷小鼠）或诱导（抗Fas抗体注射）肝细胞凋亡过程，观察肝癌发生中Bid蛋白的作用。结果1．在致癌剂DEN和凋亡诱导剂抗Fas抗体注射小鼠后8个月，在野生型小鼠肝脏内瘤结节外周BrdU标记指数显著高于Bid缺陷的小鼠（P=0．016）；2．野生型动物与Bid缺陷型动物比较，肝内瘤结节的个数、面积以及肝脏受累比率二者差异具有显著性（P值分别为0．025、0．002和0．004）。结论Bid缺陷小鼠对DEN诱导的肝癌具有明显的抵抗作用，这一作用可能与Bid的促增殖作用有关。     

蓝莓对免疫性肝纤维化大鼠细胞色素P4502E1表达的影响

目的 观察蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化的预防作用及其对细胞色素P4502E1 (CYP2E1)表达的影响.方法 将50只健康清洁级Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组)、肝纤维化模型组(B组)、蓝莓原浆预防组(C组)、复方鳖甲软肝片预防组(D组)、蓝莓原浆加复方鳖甲软肝片预防组(E组)共5组,每组10只.除正常对照组外,其余各组均腹腔注射猪血清制备大鼠肝纤维化模型,各预防组在造模同时分别给予蓝莓原浆或(和)复方鳖甲软肝片灌胃,1次/d,共12周.12周末处死大鼠,行肝脏病理组织学检查,测定各组大鼠血清ALT水平、肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及羟脯氨酸(Hyp)含量,采用实时荧光定量聚合酶联反应、Western blot和免疫组织化学法检测大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达. 结果 12周末处死大鼠,A、B、C、D、E各组大鼠血清ALT水平分别为(37.9±4.5) U/L、(49.2±9.8) U/L、(39.9±6.3) U/L、(40.5±5.7) U/L及(38.2±8.4)U/L,各组间差异无统计学意义;各预防组大鼠肝纤维化程度较B组明显减轻(F=95.097,P＜0.05); C、D、E各组大鼠肝组织匀浆Hyp分别为(472.7±44.1)μg/g、(416.1±39.4)μg/g和(429.5±55.1)μg/g,低于B组的(603.2±68.9) μg/g,F=39.315,P＜0.05,差异有统计学意义; SOD水平分别为(2.5±0.4) U/mg、(2.0±0.5)U/mg、(2.2±0.2) U/mg,高于B组的(1.6±0.4) U/mg,F=25.557,P＜0.05,差异有统计学意义;MDA分别为(0.83±0.06) mol/mg、(0.96±0.08) nmol/mg、(0.85±0.06)nmol/mg,低于B组的(1.24±0.15)nmol/mg,F=46.376,P＜0.05,差异有统计学意义;B、C、D、E组大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达高于A组,C、D、E组大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达低于B组,但差异均无统计学意义.结论 蓝莓对猪血清所致大鼠肝纤维化有一定的预防作用;免疫性肝纤维化时,大鼠肝组织CYP2E1的表达无明显改变;蓝莓对CYP2E1的表达无明显影响.     

小剂量二乙基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型的建立

目的 探讨采用小剂量二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝纤维化实验性模型的方法。方法 取Wistar大鼠30只,随机分为模型组和正常组,每组15只。给予模型组DEN溶液10 mg·kg^-1灌胃,1次/d。在10周后,处死动物,取肝组织行病理学检查和细胞超微结构观察。测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。结果 模型组动物血清ALT和AST水平分别为（410.1±93.6） U/L和（399.7±90.9） U/L,显著高于对照组【（56.51±11.2） U/L 和（63.26±10.0）U/L,P<0.001】,模型动物血清SOD、GSH-Px和MDA活性分别为（83.08±22.0) U/mg、（24.65±2.0） U/mg和（9.78±2.0) nmol/mg,与对照组比,均有显著性差异【（178.57±22.8）U/mg、（45.16±2.9）U/mg和（3.76±0.7）U/mg,P<0.01】;模型组动物肝组织肝细胞变性、增生、坏死和假小叶形成,超微结构改变以肝细胞核内异染色质增加、细胞器数量减少、基质密度降低和肝糖元减少表现为主。结论 采用小剂量DEN能成功诱导大鼠肝纤维化模型,造模成功率高,病变稳定。     

大鼠肝纤维化肝组织中抗衰老标志蛋白和抗增殖蛋白的表达研究

目的 研究猪血清所致肝纤维化大鼠肝组织中抗衰老标志蛋白(RGN)、抗增殖蛋白(PHB)表达及谷胱甘肽复方注射液(CGII)对其的干预. 方法 健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常组、造模组.正常组予等渗盐水腹腔注射0.5 ml/只,造模组予腹腔注射无菌猪血清0.5ml/只,每周两次,连续8周,随机处死造模大鼠4只行病理学检查,验证造模成功后,停止注射猪血清,剩余造模组大鼠随机分为纤维化组和CGII干预组.CGII干预组大鼠给予浓度60 mg/mlCGII肌肉注射;正常组和纤维化组均予等单位体质量容积的等渗盐水肌肉注射,每日一次,连续6周.取大鼠肝组织行HE及Masson染色.RT-PCR和免疫组织化学检测肝组织中RGN、PHB mRNA及蛋白质表达. 计量资料采用单因素方差分析,两两比较采用LDS检验,病理学半定量结果采用秩和检验分析. 结果 纤维化组大鼠肝组织RGN、PHB mRNA相对表达量分别为75.99±12.8、64.54±12.35较正常组的182.09±17.84、192.20±17.12明显减低,F值分别为105.646、347.232,P值均＜0.001,差异均有统计学意义;RGN、PHB相对蛋白表达量分别为10.85±2.81、14.5±2.75较正常组的61.08±7.10、55.86±4.23表达均明显降低,F值分别为226.343、525.889,P值均＜ 0.001,差异均有统计学意义.CGII干预后大鼠肝纤维化程度较纤维化组明显减轻(P值均＜ 0.001),肝组织RGN、PHB的mRNA和蛋白表达均较纤维化组明显增高,差异有统计学意义(P值均＜ 0.001).结论 RGN及PHB在猪血清所致大鼠肝纤维化肝组织表达降低.     

二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因

目的:首次大范围地观察二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌组织基因表达的差异,探索DEN诱发肝癌的分子机制.方法:DEN诱导大鼠肝癌,常规抽提和纯化RNA,采用AffymetrixRat230AGeneChip及技术比较肝癌组织与正常大鼠肝组织基因表达的差异.结果:在芯片的15710个基因中,肝癌有84.54%的基因阳性表达,肝癌基因表达在正常肝脏5倍以上的有509个,其中325个为EST片段,已知基因184个,其中的168个基因可以检索到有关文献的报道.在这168个基因中,有100个基因被发现与肿瘤有关,其中有36个与肝癌有关;有4个基因与肝脏有关;另有64个基因与肿瘤和肝脏无关.结论:?DEN诱发大鼠肝癌的后基因组变化中168个基因值得优先关注.     

糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达研究

目的　研究实验性糖尿病大鼠心肌细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达。方法　链脲菌素 (STZ)法复制SD大鼠实验性糖尿病模型。于模型成功后 30、4 5、6 0、75及 90d取材。原位末端标记法 (TUNEL)和免疫组化法检测细胞凋亡及心肌组织中凋亡相关蛋白的表达变化。结果　健康对照大鼠心肌仅有少量凋亡细胞 ,p5 3、Fas和Bcl 2的免疫反应阳性 ,Bax免疫反应阴性。糖尿病 30d后 ,心肌的凋亡细胞阳性指数开始升高 ,糖尿病 90d仍持续较高水平。p5 3、Fas、Bcl -2和Bax分别于糖尿病 4 5d、4 5d、4 5d和 30d开始升高 ,并于糖尿病 6 0d、75d、75d和 6 0d达高峰。结论　糖尿病大鼠心肌细胞凋亡增加 ,凋亡相关蛋白的表达水平也增加。     

iNOS在乙肝肝硬化组织中的表达及与肝细胞增殖凋亡的关系

采用免疫组化法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及增殖细胞核抗原（PCNA））在乙肝肝硬化组织（观察组）和正常肝组织（对照组）中的表达,并与TUNEL染色凋亡细胞进行相关性分析。结果观察组iNOS表达阳性率100%,对照组未见iNOS表达,两组iNOS水平有显著差异（P〈0.05）;PCNA阳性细胞数和凋亡细胞数均与iNOS表达呈正相关,P〈0.01。认为iNOS可能参与了肝硬化的发生、发展,机理为促进细胞增殖。     

蓝莓对肝纤维化大鼠血红素加氧酶-1表达的影响

目的 观察蓝莓对大鼠肝纤维化的预防作用及对血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响.方法 45只SD大鼠随机分为生理盐水对照组(A组)、模型组(B组)、蓝莓汁预防组(C组)、丹芍化纤胶囊预防组(D组)及蓝莓汁加丹芍化纤胶囊预防组(E组),每组9只.CCl4复合因素制备大鼠肝纤维化模型,各预防组给予蓝莓汁或(和)丹芍化纤胶囊灌胃,共饲养8周.测定各组大鼠血清ALT水平及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表达,并进行肝组织病理学检查.采用实时荧光定量聚合酶链反应、免疫组织化学法和Western blot分析大鼠肝组织HO 1的mRNA及蛋白质表达.多组间数据比较用单因素方差分析,等级资料用秩和检验.结果 B组大鼠血清ALT水平高于A组[(203.25±31.62)U/L比(57.25±6.88)U/L,F=92.498,P＜0.05)],各预防组较B组明显减少[C、D和E组分别为(149.44±16.51)U/L、(136.88±10.07)U/L和(127.38±11.03)U/L,F=92.498,P＜0.05)].C、D、E组大鼠肝组织匀浆SOD水平分别为(1.36±0.09)U/mg、(1.42±0.13)U/mg、(1.50±0.15)U/mg,高于B组的(1.08±0.19)U/mg(F=13.671,P＜0.05);MDA水平分别为(0.294±0.026)nmol/mg、(0.285±0.025)nmol/mg、(0.284±0.028)nmol/mg,低于B组的(0.335±0.056)nmol/mg(F=20.809,P＜0.05).各预防组肝纤维化程度较B组也有所减轻(x2-24.956,P＜0.05).B组大鼠肝组织HO-1的mRNA和蛋白质表达高于A组(F值分别为4.549和22.926,P值均＜0.05),各预防组大鼠肝组织HO-1的mRNA和蛋白质表达均高于B组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 蓝莓对CCl4所致大鼠肝纤维化有一定的预防作用;在慢性肝损伤时,蓝莓对HO-1的表达无明显影响.     

贝伐单克隆抗体对二乙基亚硝胺诱导的原发性肝癌大鼠的防治作用及其对肝癌组织VEGF表达的影响

目的 研究抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体对二乙基亚硝胺（DEN）所致原发性肝癌大鼠的干预作用及其对肝组织VEGF表达的影响。方法 将30只SD 大鼠随机分为正常组、模型组和药物干预组。采用联合应用四氯化碳和DEN法制备原发性肝癌模型,并给予抗VEGF单克隆抗体腹腔注射干预,在正常组和模型组则给予等体积生理盐水注射。连续干预12 w。实验结束,取血和肝组织行相关检查,采用免疫组化法检测肝组织VEGF表达。结果 药物干预组大鼠肝质量、肝表面癌结节数,癌变率和肝脏指数分别为（17.51±2.53）g、（6.86±0.82）个、30%和（4.10±0.79）,均明显低于模型组的【（23.71±3.01）、（21.91±2.75）、100.0%和（5.90±1.01）,P<0.05】;与模型组比,药物干预组大鼠血清AST、ALT和TBIL水平分别为（101.58±19.83） IU/L、（241.52±36.58） IU/L和（62.93±3.03） μmol/L,均明显低于模型组（P<0.05）;病理学检查结果显示,与模型组比,药物干预组动物肝组织损伤明显减轻;免疫组化检测结果则显示,模型组、正常组和药物干预组VEGF相对表达量分别为（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81）,差异显著（P＜0.05）。结论 抗VEGF单克隆抗体对DEN诱导的原发性肝癌大鼠具有较好的抑瘤作用,而这种作用可能与其抑制了肝组织VEGF表达有关。     

不同浓度CCl4注射联合饮用乙醇诱导大鼠肝硬化模型研究

目的 探索不同浓度CCl4联合饮用乙醇制备大鼠肝硬化模型,寻求最佳的药物和乙醇浓度。方法 取90只SD大鼠, 分为对照组10只和实验组A组、B组、C组和D组,每组20只,给予不同浓度的CCl4油溶液腹腔注射,同时以不同浓度的乙醇溶液为饮用水,制备肝硬化模型。结果 在实验12 w末,A组大鼠死亡10只, B组死亡8只,C组死亡4只,D组死亡5只;实验A组肝细胞走向紊乱,纤维组织增生,纤维间隔形成。有假小叶形成,肝细胞大小不一,呈点灶状坏死,肝细胞凋亡、再生,汇管区内炎细胞浸润;B组与A组变化相似;C组肝细胞走向紊乱,纤维间隔形成,但无假小叶形成,肝细胞脂肪变性,纤维组织增生,肝细胞凋亡,汇管区内炎细胞浸润;D组与C组表现类似。结论 适当浓度的CCl4油溶液结合乙醇溶液为饮用水诱导大鼠肝硬化模型可显著提高造模成功率。     

Thy1.1阳性肝脏卵圆细胞在大鼠肝硬化形成与消减过程中的动态表达

目的 肝脏卵圆细胞（HOC）在二甲基亚硝胺（DMN）致大鼠肝硬化形成与消减过程中表达的动态变化，探讨其病理生理意义。方法 应用DMN腹腔注射（4周12次）制备大鼠肝硬化模型，分别于造模后3d、2、4周及终止造模后2、4周处死大鼠取肝组织，进行常规组织学观察，透射电镜下观察HOC超微结构，免疫组织化学和western blot方法检测Thy1．1的表达变化，应用图像分析法对所标记的HOC进行半定量测定以及光镜下计数细胞数量。结果 DMN造模4周大鼠已形成典型的肝硬化；终止造模后2周时肝组织病变较造模4周时有所减轻，终止造模后4周时炎症明显减轻并以不完全纤维间隔为主。Thy1．1阳性染色细胞正常大鼠肝组织未见到，造模后3d时可见微量表达，2周时呈散在分布，4周时明显增多，见于纤维间隔周围，终止造模后2周、即第6周时阳性染色显著强于造模4周，大量出现于汇管区，8周时较6周有所减少，表达量基本与4周时相等。阳性染色图像分析、光镜下阳染细胞计数及western blot三者的结果呈一致性。Western blot结果与免疫组织化学观察结果也具一致性。电镜下显示HOC具有形态小，核以卯圆型为主，高的核／浆比例等特点。结论 Thy1．1阳性的HOC可能与肝硬化的消减或逆转有关。     

生长激素联合肠内营养对肝硬化大鼠围手术期肝功能的作用

目的探讨重组人生长激素联合肠内营养对围手术期肝硬化大鼠肝功能的影响。方法将32只肝硬化肝部分切除术后雄性Wistar大鼠随机分为对照组、肠内营养组(EN组)、生长激素组(GH组)、肠内营养联合生长激素组(EN+GH组),每组8只,5天后检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)。结果 EN+GH组血清ALB水平均高于GH组、EN组及对照组,P均0.05,差异均有显著统计学意义;GH组、EN组血清ALB水平均显著高于对照组,P均0.05,差异均有显著统计学意义;EN+GH组血清AST、ALT水平均显著低于对照组,P均0.05,差异均有显著统计学意义。EN组血清AST、ALT水平均低于GH组,P均0.05,差异均有显著统计学意义,但EN+GH组血清AST、ALT水平与EN组比较,P均0.05,差异均无显著统计学意义。结论肠内营养联合重组人生长激素有改善肝硬化大鼠肝功能的作用,且在改善低蛋白血症的作用优于各药单独使用,但在降酶方面的作用与肠内营养药物单独使用无显著差别。     

酒精性肝病大鼠肝组织解偶联蛋白2的表达

解偶联蛋白(UCP)是线粒体内膜上可以调节质子跨膜转运的载体蛋白,具有解偶联活性,目前共发现5个亚型[1-2].其中U CP2通过调节质子跨膜转运参与能量消耗和脂质代谢,可能参与酒精性肝病(ALD)发病过程中的氧化应激与脂质过氧化.本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,动态观察UCP2蛋白及mRNA的表达情况,以探讨UCP2在ALD发病过程中的作用及其机制,为有效防治ALD提供新的理论依据.     

醛固酮拮抗剂对肝纤维化大鼠NOX4蛋白表达的抑制作用

目的 探讨醛固酮拮抗剂对肝纤维化大鼠NOX4蛋白表达的抑制作用. 方法 体内实验:雄性Wistar大鼠24只,随机分为3组,每组8只.模型组:用四氯化碳(CCl4)油2.5 ml/kg皮下注射,3次/周;安体舒通组:CCl4油注射的同时予以安体舒通20 mg/kg灌胃,1次/d;对照组:用橄榄油皮下注射,于4周后处死实验动物取材.用HE染色观察肝组织形态结构;Masson染色进行METAVIR肝纤维化评分;免疫组织化学法检测NOX4蛋白的表达.体外实验:将大鼠HSC-T6细胞株与不同剂量的醛固酮(10-9、10-7、10-5 mol/L,观察剂量效应)作用不同时间(6、12、24h)以观察时间效应.给予醛固酮(Ald)1μmol/L、依普利酮1μmol/L预处理60min,再给予Ald刺激大鼠HSC-T6细胞,设立阴性对照组.Western blot方法检测NOX4蛋白的表达.采用Oneway ANOVA方差分析法,首先用Levene方法进行方差齐性检验,确定方差齐且整体比较组间差异有统计学意义后进一步做多重比较,多重比较采用LSD法. 结果 CCl4组纤维化程度较对照组明显增高(相对表达量为16.060±0.300比2.471±0.160),两组比较,差异有统计学意义.CCl4+Sp组纤维化程度较CCl4组低(相对表达量为5.761±0.152比16.060±0.300),两组比较,差异有统计学意义.免疫组织化学结果显示,与对照组相比,CCl4组NOX4蛋白表达明显增高(相对表达量为7.231±0.211比1.350±0.252),两组比较,差异有统计学意义.与CCl4组相比,CCl4+Sp组NOX4蛋白表达下降(相对表达量为4.270±0.242比7.231±0.211),两组比较,差异有统计学意义.Ald刺激HSC-T6细胞后NOX4蛋白表达增强,并呈时间、浓度依赖性,在10-5 mol/L浓度刺激24h达到峰值;与对照组相比,Ald组NOX4表达明显增加(相对表达量为0.710±0.011比0.316±0.015),两组比较,差异有统计学意义.与Ald组相比,Ald+依普利酮组NOX4的表达减少(相对表达量为0.615±0.014比0.710土0.011),两组比较,差异有统计学意义.结论 醛固酮拮抗剂通过抑制Ald诱导的氧化应激效应抑制肝纤维化大鼠NOX4蛋白的表达.