炎症因子IL-1β和TNF-α可通过骨髓间充质干细胞降低多西环素对骨髓瘤细胞株H929的细胞毒性作用

目的：骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在骨髓微环境中参与骨髓瘤细胞的耐药性。本实验旨在通过体外实验,研究炎症因子处理的骨髓间充质干细胞在与骨髓瘤细胞株H929共培养条件下,是否影响多西环素（Doxycycline,DOX）对人骨髓瘤细胞株的细胞毒性作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法：分别采用CCK8法和流式细胞术（FCM）,检测肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ或白细胞介素（IL）-1β预处理的人骨髓MSC,与H929细胞共培养过程中,DOX对H929细胞增殖和凋亡的影响;采用FCM和实时聚合酶链反应（RT-PCR）法检测IL-1β或TNF-α处理后,骨髓MSC的血管细胞粘附因子VCAM-1表达;Western Blot方法用于检测在DOX存在时,不同处理的骨髓MSC作为共培养饲养层细胞的条件下,H929细胞经DOX药物处理后p-Erk1/2变化。结果：DOX可抑制骨髓瘤细胞株H929的增殖并诱导其凋亡。人骨髓MSC与H929共培养可以减少DOX对H929的细胞毒性作用,而经IL-1β或TNF-α预处理的人骨髓MSC再与H929共培养,则可以进一步降低DOX的细胞毒性作用。人骨髓MSC经IL-1β或TNF-α处理后,其VCAM-1的mRNA转录水平和细胞表面蛋白表达水平均升高。经炎症因子预处理的骨髓MSC与H929共培养后,可以降低DOX对骨髓瘤细胞株p-Erk1/2的下调作用。结论：DOX在体外对骨髓瘤细胞株表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性作用;而炎症因子IL-1β和TNF-α可以通过骨髓MSC来间接拮抗DOX对H929的细胞毒性作用;IL-1β和TNF-α的这一作用的机制可能与上调骨髓MSC的VCAM-1表达与下调p-Erk1/2有关。     

IL⁃1β和TNF⁃α通过骨髓MSCs降低多西环素对骨髓瘤细胞株H929的细胞毒性作用

目的：骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在骨髓微环境中参与骨髓瘤细胞的耐药性。本研究旨在通过体外实验,研究经细胞因子预处理的骨髓MSCs在与人骨髓瘤细胞株H929共培养条件下,是否影响多西环素（doxycycline,DOX）对骨髓瘤细胞株的细胞毒性作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法：经白细胞介素（interleudin,IL）?1β或肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?ɑ预处理的人骨髓MSCs,与H929细胞共培养,并以DOX处理细胞,分别采用CCK8法和流式细胞术（FCM）,检测DOX对H929细胞增殖和凋亡的影响;采用FCM和实时荧光定量PCR（RT?qPCR）法检测IL?1β或TNF?α处理后,骨髓MSCs中血管细胞黏附分子（VCAM?1）表达;Western blot法检测在DOX存在时,不同处理的骨髓MSCs作为共培养饲养层细胞的条件下,H929细胞p?Erk1/2的变化。结果：DOX可抑制骨髓瘤细胞株H929的增殖并诱导其凋亡。人骨髓MSCs与H929共培养可以减少DOX对H929的细胞毒性作用,而经IL?1β或TNF?α预处理的人骨髓MSCs再与H929共培养,则可以进一步降低DOX的细胞毒性作用。人骨髓MSCs经IL?1β或TNF?α处理后,其VCAM?1 mRNA转录水平和蛋白表达水平均升高。经预处理的骨髓MSCs与H929共培养后,可以降低DOX对骨髓瘤细胞株p?Erk1/2的下调作用。结论：DOX在体外对骨髓瘤细胞株表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性作用;而IL?1β和TNF?α可通过骨髓MSCs来间接拮抗DOX对H929的细胞毒性作用;IL?1β和TNF?α的这一作用机制可能与上调骨髓MSCs的VCAM?1表达与上调p?Erk1/2有关。     

异丙酚对H2O2增强肿瘤坏死因子-α诱导血管内皮细胞凋亡效应的抑制作用

目的:探索H2O2对TNF-α诱导血管内皮细胞凋亡的作用及异丙酚(propofol)对细胞凋亡的保护作用和可能的机制。方法:将体外培养的ECV304细胞分为5组:①对照组(Control);②10μmol/L H2O2组(H);③40 nmol/L TNF-α组(T);④TNF-α+H2O2组(T+H);⑤TNF-α+H2O2+propofol组(T+H+P)。观察:①流式细胞仪检测细胞凋亡率;②丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量。结果:10μmol/L的H2O2仅造成少量细胞凋亡,MDA含量变化不显著(P>0.05);与TNF-α共同作用后细胞凋亡率显著增加,且高于二者分别作用之和,细胞内MDA含量也明显增加,SOD和GSH-Px含量明显减少,与TNF-α组相比差异具有显著性(P<0.05);加入异丙酚预处理可使TNF-α和H2O2组凋亡率明显降低,同时伴随细胞内MDA含量降低,SOD和GSH-Px含量增加。结论:H2O2能显著增强TNF-α诱导细胞凋亡的效应,异丙酚通过降低细胞氧化损伤的机制,有效逆转H2O2增强TNF-α诱导细胞凋亡的效应。     

多发性骨髓瘤组织微小RNA-19表达及其临床意义

目的检测微小RNA-19(miRNA-19)在多发性骨髓瘤(MM)病人骨髓单个核细胞(BMMNC)中表达水平,探讨miRNA-19表达与MM发生、发展及预后的关系。方法收集43例MM病人及20例正常对照者的骨髓标本,采用D-S分期法对MM病人进行临床分期,Ficoll法获取BMMNC,实时荧光定量PCR方法检测BMMNC中miRNA-19表达,同步采集外周血,检测β2微球蛋白(β2-MG)的水平。结果 MM病人BMMNC中miRNA-19表达水平明显高于正常对照组,复发、难治组MM病人miRNA-19表达水平明显高于初治组MM病人,差异有显著性(t=5.82,P<0.05)。MM病人化疗后miRNA-19表达水平较化疗前明显降低(t=2.61,P<0.05),其中以化疗有效组降低最为明显(t=3.83,P<0.05),无效进展组miRNA-19表达水平化疗前后无明显改变。D-S分期Ⅲ期病人miRNA-19表达水平明显高于Ⅱ期病人(t=3.54,P<0.05)。β2-MG≥4.0mg/L病人miRNA-19表达水平较β2-MG<4.0mg/L组明显升高(t=4.09,P<0.05)。结论 miRNA-19过表达在MM的发病中发挥着重要作用,miRNA-19过表达与MM肿瘤细胞的增殖、化疗效果和疾病预后有密切关系;miRNA-19可能作为判断MM病人预后不良指标之一。     

间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的疗效和免疫调节机制

目的 观察间充质干细胞(MSC)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效并探讨其免疫调节机制.方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和弗氏完全佐剂诱导建立C57BL/6小鼠EAE模型,随机分为MSC治疗组和EAE组.分离纯化培养GFP-C57BL/6小鼠骨髓MSC细胞.在EAE诱导后的第15天,MSC治疗组以每只1×106/400 μL的量经尾静脉注射MSC细胞,EAE组尾静脉注射400 μL PBS.采用临床评分和脊髓组织切片评估小鼠的发病情况,ELISA检测小鼠外周血细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)和转化生长因子p(TGF-β)的含量,流式细胞术分析小鼠脾脏细胞中CD4+ Foxp3+T细胞(Treg)的比例变化和GFP+细胞在受体小鼠体内的比例变化.结果 与EAE组相比,MSC治疗组小鼠的临床评分降低(P＜o.05);脊髓组织切片中T细胞浸润减少;血浆中细胞因子IL-4和TGF-β的含量升高,而IFN-γ和TNF-α降低;脾脏细胞中CD4+Foxp3+T细胞(Treg)的比例明显升高.移植10 d后MSC消失.结论 MSC移植对小鼠EAE疗效显著.MSC通过增加血浆中抗炎因子IL-4和TGF-β的含量,降低促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量,从而促使原始T细胞向Treg细胞分化,发挥免疫调节作用,且MSC消失后一段时间仍对EAE有一定治疗作用.     

多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6和TNF-α的表达及其临床意义

目的 研究骨髓瘤骨髓基质细胞(BMSCs)分泌的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在多发性骨髓瘤(MM)进展中的变化和意义以及人脐血源基质细胞(hUCBDSCs)分泌IL-6和TNF-α的水平.方法 用ELISA法检测单独培养的hUCBDSCs 和骨髓瘤BMSCs以及它们与KM3细胞共培养后IL-6 、TNF-α在培养上清液中的浓度.结果 (1)单独培养和共培养时骨髓瘤BMSCs分泌IL-6和TNF-α的水平高于hUCBDSCs;(2)共培养后骨髓瘤BMSCs和hUCBDSCs分泌IL-6和TNF-α的水平明显高于共培养前;(3)Ⅲ期患者BMSCs分泌IL-6的水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,但是TNF-α水平无变化.结论 IL-6与MM的进展有关;hUCBDSCs表达IL-6和TNF-α的水平较骨髓瘤BMSCs低.     

MiRNA-19a靶向SMO基因调控Hedgehog信号通路影响骨髓瘤细胞生物学特性的机制研究

  目的  探索miRNA-19a对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和转移的影响,及对SMO蛋白和Hedgehog信号通路的影响。  方法  人骨髓瘤细胞系U266B1、LP-1、RPMI 8226和NCI-H929为研究模型,首先检测4种细胞中SMO蛋白的背景表达,然后使用U266B1细胞作为模型,设计了miRNA-19a inhibitor,以此建立miRNA-19a敲低组、对照质粒组和空载组。探究miRNA-19a敲减后细胞中SMO蛋白含量以及细胞增殖、凋亡和转移的变化。采用MTT法检测细胞毒性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell试验检测细胞侵袭能力。  结果  SMO蛋白在U266B1、LP-1、RPMI 8226和NCI-H929细胞系中表达量分别为0.925±0.057、0.889±0.067、0.904±0.075、0.507±0.048,其中以NCI-H929细胞系中表达量较低(P < 0.05)。MiRNA-19a敲低组、对照质粒组和空载组miRNA-19a含量分别为0.325±0.058、1.158±0.128、1.172±0.131,miRNA-19a敲低组miRNA-19a含量显著降低(P < 0.05)。对照质粒组、miRNA-19a敲低组和空载组SMO蛋白表达量分别为0.787±0.104、0.354±0.068、0.807±0.106,miRNA-19a敲低组SMO蛋白含量明显降低(P < 0.05)。MTT实验显示,miRNA-19a敲低组细胞增殖OD值在24~72 h内明显低于空载组和对照质粒组(均P < 0.05)。凋亡实验显示,miRNA-19a敲低组细胞凋亡率明显高于空载组和对照质粒组(均P < 0.05)。Transwell实验显示,miRNA-19a敲低组侵袭细胞数明显低于其他2组(均P < 0.05)。  结论  miRNA-19a/SMO蛋白可能是骨髓瘤细胞系U266B1中控制细胞恶性增长的关键信号,可以作为多发性骨髓瘤治疗的潜在靶点。      

白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和Dickkopf1在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

目的目前,已发现骨髓造血微环境对骨髓瘤的发病起重要的作用。骨髓基质细胞和骨髓瘤细胞分泌多种细胞因子,如白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、Dickkopf1(DKK1)等,对疾病进展及预后非常重要。文中探讨多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者血清IL-6、TNF-α、DKK1的表达及其临床意义。方法采用ELISA法测定39例MM患者与10名健康对照者血清中IL-6、TNF-α、DKK1的水平。将患者分为初发及进展期组和稳定期组2组进行分析。结果初发及进展期组血清IL-6、TNF-α水平明显高于稳定期和对照组,IL-6分别为(45.30±42.11)pg/ml(初发及进展期组)、(19.64±14.06)pg/ml(稳定期组)、(12.62±14.71)pg/ml(对照组),P<0.05。TNF-α分别为(8.72±5.46)pg/ml(初发及进展期组)、(4.77±2.45)pg/ml(稳定期组)、(4.97±2.52)pg/ml(对照组),P<0.05。稳定期与对照组患者血清IL-6、TNF-α水平无统计学差异。初发及进展期组血清DKK1水平与对照组比较有统计学差异,稳定期组患者血清DKK1水平与对照组比较无统计学差异。DKK1分别为(12825.40±9136.55)pg/ml(初发及进展期组)、(6847.11±4374.93)pg/ml(稳定期组)、(2973.66±877.84)pg/ml(对照组),P<0.05。结论血清IL-6、TNF-α、DKK1的水平可能与MM的发生、发展有关。测定血清IL-6、TNF-α、DKK1水平对于MM病情评估和监测治疗效果有一定意义。     

骨髓间充质干细胞在体外肠上皮环境下免疫调节的作用机制

目的观察异基因骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外肠上皮细胞环境中产生免疫调节的机制。方法挑选培养状态良好的结肠癌细胞系CaCo-2,提取Wistar大鼠骨髓MSCs及新鲜脾淋巴细胞做共培养。实验分4组,实验组为脾淋巴细胞、骨髓MSCs、CaCo-2共培养+刀豆蛋白A(ConA),对照组为脾淋巴细胞、CaCo-2共培养+ConA,增殖组为脾淋巴细胞+ConA,空白组为单纯脾淋巴细胞。分别于培养0、24、48 h后,MTT检测T细胞活性,ELISA检测细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)及转化生长因子-β(TGF-β)水平,流式检测Foxp3+调节性T细胞表达率。结果在单层肠上皮共培养环境下,与对照组比较,实验组T细胞活性显著降低(P<0.05),TNF-α也有显著降低(P<0.05),IL-10、TGF-β表达水平有显著升高(P<0.05);Foxp3+调节性T细胞表达率升高;T细胞活性随着时间延长有逐渐降低趋势(P<0.05)。结论在体外单层肠上皮细胞环境中,骨髓MSCs可以通过直接抑制T细胞活化产生TNF-α抑制免疫应答,并可间接通过自分泌及诱导调节性T细胞产生并分泌免疫抑制因子IL-10、TGF-β下调免疫反应,产生免疫耐受。     

致敏树突状细胞介导CTL抗骨髓瘤免疫的实验研究

目的比较两种树突状细胞(骨髓瘤致敏DC和未致敏DC)诱导的细胞毒T淋巴细胞抗自身骨髓瘤的细胞免疫.方法用多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓CD34+细胞诱生DC,将MM患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC.MTT法检测骨髓瘤抗原致敏和未致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率.结果骨髓瘤冻融物致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤率远大于非致敏DC.结论患者骨髓瘤冻融物致敏的DC能有效诱导自身T细胞抗骨髓瘤免疫.