弓形虫棒状体蛋白2重要家族成员核酸疫苗的研究进展

弓形虫呈世界性分布,可感染几乎所有的温血动物并引起弓形虫病,目前已成为危害人类健康和影响畜牧业生产的重要公共卫生问题,但迄今尚无理想的药物和防治手段。伴随着弓形虫重要毒性因子作用机制研究的日趋深入,研制安全有效的抗虫疫苗是防治弓形虫病的有效策略。棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)是弓形虫在入侵宿主细胞过程中向宿主胞内分泌的效应蛋白因子,因在弓形虫入侵及逃避宿主免疫清除过程中发挥着重要的作用,目前已成为研制弓形虫疫苗的重要候选分子,其中棒状体蛋白2(ROP2)家族是研究最为深入的重要成员。本文就近年来ROP2家族重要成员的疫苗研究进展进行综述,旨在为研发安全有效的抗弓形虫病疫苗提供思路。     

弓形虫棒状体蛋白研究进展

弓形虫的棒状体蛋白（Ｒｈｏｐｔｒｙｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＯＲ）是棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白，其中研究最多的是ＲＯＰ１及ＲＯＰ２。研究认为ＲＯＰ２是最具潜力的疫苗候选因子，已用于弓形虫病的ＥＬＩＳＡ检测，本概述了ＲＯＰ的研究进展。     

弓形虫棒状体蛋白研究进展

弓形虫的棒状体蛋白(Rhoptry protein,POR)是棒状体分泌的对弓形虫侵入宿主细胞起重要作用的蛋白,其中研究最多的是ROP1及ROP2。研究者认为ROP2是最具潜力的疫苗候选因子,已用于弓形虫病的ELISA检测。本文概述了ROP的研究进展。     

刚地弓形虫DNA疫苗的研究进展

疫苗是防治弓形虫病的有效手段之一。弓形虫疫苗研制经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等4个发展阶段。弓形虫DNA疫苗较传统疫苗虽有诸多优势,但尚处于研究起步阶段,单价DNA疫苗和佐剂增强型DNA疫苗可诱导机体对弓形虫感染产生细胞免疫和体液免疫,但免疫效果并不理想,复合多重DNA疫苗将是弓形虫疫苗今后的发展趋势。此外,弓形虫DNA疫苗的免疫保护机制和安全性还不十分清楚,进一步探讨疫苗免疫机制和弓形虫免疫逃避机制,将有助于研制高效、安全、实用的弓形虫DNA疫苗。     

弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究现状

弓形虫病目前尚无理想的特效治疗药物和防治措施,研制安全便捷、保护力强的核酸疫苗是弓形虫病防治的有效策略。棒状体蛋白（Rhoptry protein, ROPs）是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的一类蛋白,其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫空泡（Parsitophorous vacuole, PV）形成及胞内弓形虫的增殖调控等方面发挥着重要作用,是最具潜力的疫苗候选抗原分子之一。本文就ROPs家族重要成员特性、表达载体选择及其核酸疫苗在动物实验中的免疫原性,以及免疫保护作用等方面进行了概述。     

弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展

棒状体蛋白16（ROP16）是弓形虫棒状体蛋白家族成员, 其蛋白结构存在丝氨酸、 苏氨酸激酶区, 是弓形虫入侵 过程中的重要毒力因子。ROP16可分泌到宿主细胞核, 能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6, 干扰宿主细胞信号 通路传导, 在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。本文对弓形虫ROP16的发现、 功能、 免疫保护性等方面进行 综述。     

刚地弓形虫分子诊断的研究进展

刚地弓形虫感染是一种在世界范围内流行的寄生虫病,严重危害人体健康,给全世界的畜牧业带来巨大的经济损失.传统的弓形虫病原学诊断方法较为费时且不稳定,以核酸扩增为基础的分子生物学技术省时省力,为弓形虫病的诊断提供了重要依据.     

刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展

菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白，将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。     

刚地弓形虫toxofilin蛋白的研究进展

Toxofilin是刚地弓形虫棒状体蛋白家族成员,但该蛋白有一定的特殊性,其结构中不存在棒状体蛋白典型丝氨酸、苏氨酸激酶区。Toxofilin分泌到宿主细胞质中,能与磷酸脂酶2C(PP2C)、肌动蛋白(actin)相互作用,形成toxofilin-actin-PP2C三聚体复合物,被酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)和PP2C激活发生磷酸化,在弓形虫入侵细胞过程中发挥重要作用。本文综述了弓形虫toxofilin的发现及其功能和免疫保护性等方面的研究进展。     

弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫。因其复杂的生活史和致病机理,目前尚无有效的专用药物进行治疗。近年来,关于抗弓形虫免疫及疫苗的研究逐步深入,棒状体颈部蛋白（RONs）及棒状体蛋白（ROPs）作为重要的抗弓形虫疫苗的候选抗原分子,广泛应用于新型抗弓形虫疫苗的研究中。本文总结了近几年来弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白的研究新进展,尤其是这些RONs及ROPs作为新型DNA疫苗分子研。宽的最新进展。     

刚地弓形虫棒状体蛋白17激活活化蛋白1信号抑制小鼠巨噬细胞凋亡

目的检测刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白17(rhoptry protein 17,ROP17)对γ干扰素(IFN-γ)诱导的小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡的调控作用。方法将重组质粒p3×Flag-CMV-14/Tg ROP17和p3×Flag-CMV-14空质粒(对照组)转染J774A.1细胞后,加入重组IFN-γ诱导细胞凋亡,通过流式细胞术和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP17对细胞凋亡的调控作用,检测c-Jun磷酸化水平及活化形式的半胱天冬酶3(Caspase 3)、Bcl-2、Bcl-x L和Bcl-3等凋亡相关蛋白的表达情况。J774A.1细胞共转染p3×FlagCMV-14/Tg ROP17和c-Jun sh RNA,加入重组IFN-γ诱导细胞凋亡,Western blotting检测ROP17对凋亡的调控作用及凋亡相关蛋白Bcl-3的表达。结果流式细胞术显示,过表达ROP17组细胞凋亡率为(3.73±0.51)%,明显低于对照组的(7.78±1.10)%(P0.05)。Western blotting结果显示,过表达ROP17组磷酸化c-Jun蛋白相对表达量为0.196±0.028,对照组为0.075±0.010(P0.05);Bcl-3相对表达量为0.461±0.063,对照组为0.108±0.013(P0.05)。活化形式的Caspase 3相对表达量为0.015±0.004,对照组为0.174±0.026(P0.05)。Bcl-2在过表达ROP17组和对照组中的相对表达量分别为0.119±0.013和0.117±0.018,Bcl-x L则分别为0.124±0.015和0.121±0.023,差异均无统计学意义(P0.05)。在c-Jun sh RNA有效抑制c-Jun及其磷酸化表达的条件下,活化形式的Caspase 3在RNA干扰组和对照组的相对表达量分别为0.147±0.024和0.087±0.010(P0.05),Bcl-3则分别为0.085±0.010和0.162±0.011(P0.05)。结论ROP17抑制IFN-γ诱导的J774A.1细胞凋亡依赖于c-Jun的磷酸化及Bcl-3的表达。     

刚地弓形虫棒状体蛋白ROP16对小鼠脑神经细胞凋亡的影响

目的构建带有Flag标签的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16(ROP16)的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响。方法PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证。将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)中进行慢病毒包装,以p CDH-CMV-cop GFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度。将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP16蛋白的表达情况。应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区,2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况。结果重组慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因(Gen Bank登录号为GQ249093.1)序列比对完全一致。包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E+8 TU/ml。Western blotting分析结果显示,在相对分子质量(Mr)120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白。感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组。结论构建的慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡。     

刚地弓形虫滑行相关蛋白的研究进展

顶复门寄生虫入侵宿主细胞的能力是其生存和致病的关键。刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是顶复门的一种专性细胞内寄生虫,无论其滑行、入侵或逸出感染细胞,都必须依靠被称为肌-动球蛋白马达(actomyosin motor,AMM)的装置提供动力。AMM主要由肌球蛋白A、1条肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC1)和2条必需轻链(essential light chain,ELC)1、2以及滑行相关蛋白(gliding-associated protein,GAP)组成。目前已经发现的GAP家族包括GAP45、GAP50、GAP80、GAP70和GAP40,它们是构成驱动寄生虫运动的滑行体的重要成分。滑行体是一个存在于寄生虫质膜与内膜复合物之间的以肌-动球蛋白为基础的动力装置。本文概述了目前对GAP构建与功能的理解以及弓形虫运动的分子基础,同时对GAP作为弓形虫病疫苗候选抗原分子作了展望。     

刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族的研究进展

肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)/丝切蛋白(cofilin)家族是一类肌动蛋白结合蛋白(actin-binding proteins,ABP),其家族成员均可与肌动蛋白结合,具有促进微丝解聚的作用,从而提高肌动蛋白单体水平,在重塑肌动蛋白骨架中起重要作用。ADF在顶端复合门寄生虫侵入宿主细胞过程中扮演重要角色。本文综述了刚地弓形虫ADF/cofilin家族的结构特点、调控肌动蛋白动力学机制、参与弓形虫侵入宿主及其在抗弓形虫感染等方面的作用。     

刚地弓形虫棒状体蛋白18和膜表面抗原30复合核酸疫苗对小鼠的免疫保护作用

目的 研究刚地弓形虫棒状体蛋白18 (ROP18)和膜表面抗原30 (P30)复合核酸疫苗的免疫保护作用。方法 PCR扩增弓形虫p30和rop18基因,构建pVAX1-p30、pVAX1-rop18-p30质粒并进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。用Lipofectamine^TM3000转染试剂将pVAX1 (2μg)和pVAX1-rop18-p30质粒转染至HeLa细胞内,24 h后间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况。75只雌性BALB/c小鼠随机分为pVAX1-rop18-p30组、pVAX1-rop18组、pVAX1-p30组、pVAX1组和PBS组,每组15只,分别于股四头肌注射100μg (100μl)的pVAX1-rop18-p30、pVAX1-rop18 (本实验室保存)、pVAX1-p30、pVAX1质粒或PBS (100μl),共免疫3次,间隔2周,末次免疫时质粒剂量为200μg。每次免疫前和末次免疫后2周采集小鼠血样,ELISA检测血清IgG抗体水平。末次免疫后2周每组取3只小鼠,无菌取脾细胞,培养后ELISA检测培养上清中γ干扰素(IFN-...     

刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

目的观察刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒状体蛋白16(ROP16)在入侵宿主细胞过程中的分泌及分布。方法以刚地弓形虫RH株速殖子c DNA为模板,PCR扩增Tgrop16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组蛋白Tg ROP16经纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗Tg ROP16多克隆抗体,用蛋白质印迹(Western blotting)和间接ELISA检测抗Tg ROP16多克隆抗体的特异性和敏感性。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测刚地弓形虫RH株和Pru株速殖子Tgrop16基因的转录水平,Western blotting分析RH株和Pru株Tg ROP16蛋白的表达量。用间接免疫荧光(IFA)检测弓形虫RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纤维细胞(HFFs细胞)过程中,Tg ROP16蛋白在宿主细胞中的分泌与分布。结果制备的抗Tg ROP16多克隆抗体,Western blotting分析结果显示,能与重组蛋白Tg ROP16结合,在相对分子质量(Mr)约100 000处有一特异性条带;间接ELISA检测结果显示,抗体效价为1∶25 600。实时荧光定量PCR检测结果显示,Pru株Tgrop16基因表达量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P0.05)。Western blotting分析结果显示,RH株中Tg ROP16蛋白表达量(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.373)较高于Pru株(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.232)。IFA检测结果显示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白定位于速殖子的顶端复合体,速殖子入侵HFFs细胞后,Tg ROP16蛋白显示在虫体外。结论制备的抗Tg ROP16多克隆抗体特异性和敏感性高;刚地弓形虫RH株速殖子的Tg ROP16蛋白表达量高于Pru株的;两株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白分布于速殖子顶端复合体,在入侵宿主细胞过程中被分泌出虫体。     

弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞互作的研究进展

棒状体蛋白是弓形虫分泌于宿主细胞的主要效应因子, 定位于宿主细胞的不同部位, 并与其存在复杂的相互作 用。通过调控膜系及骨架结构, 该蛋白可影响宿主细胞的生物活性因子, 从而阻断其内在的防御机制, 使弓形虫成功实 现胞内入侵、 寄生及增殖。棒状体蛋白对宿主细胞的功能及作用方式反映了弓形虫的致病机制, 对探寻治疗弓形虫病的 药物靶点及安全有效的疫苗候选分子意义重大。本文就近年来弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞间相互作用的研究进展进 行综述。     

刚地弓形虫蛋白质组学研究进展

近10年,蛋白质组学技术广泛应用于刚地弓形虫研究中,研究结果为全面深入揭示该虫体的生命活动本质奠定了基础。目前,关于刚地弓形虫的整体蛋白质组学研究仅限于速殖子和卵囊阶段的蛋白质组学;亚蛋白质组学研究包括一些重要抗原,如可溶性速殖子抗原、糖蛋白和免疫蛋白质组学研究等;差异蛋白质组学研究着眼于阐明不同虫株或不同虫种的差异蛋白。本文综述了弓形虫蛋白质组学的研究现状,详细阐述了弓形虫整体蛋白质组学、亚蛋白质组学和差异蛋白质组学的主要研究进展。此外,本文还概述了弓形虫蛋白质组学的生物信息学平台,并对弓形虫蛋白质组学的应用前景进行了展望。     

刚地弓形虫表面抗原研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种细胞内寄生原虫,可感染任何有核细胞,无论人或动物,感染率都很高。和其它细胞一样,弓形虫的表膜具有重要的作用,既是虫体与外界环境进行物质交换的界面,也是宿主免疫系统识别并杀伤虫体的主要部位。Handman,Goding和Remington(1980)首先对弓形虫表面抗原进行了分析,其后Johnson(1983)、Dubremetz(1985)、Rodriguez(1985)、Kasper(1982,1984,1987)亦对一些表面抗原进行了研究,虽然已发现的抗原种类很多,但由于技术方法差异,命名很混乱。G.Couver(1980)利用单克隆抗体技术对表面抗原进行了确认。随着分…