McAb-ELISA检测血吸虫循环抗原——Ⅰ.McAb的制备、筛选及初步试验

将感染日本血吸虫或曼氏血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,制备了30余株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤,其靶抗原分别为血吸虫成虫表面膜、肠道、体细胞和虫卵。预试验结果表明,抗血吸虫成虫肠道多糖抗原McAb活性最强,将其用于夹心ELISA检测血吸虫成虫三氯醋酸可溶性抗原,敏感度达1ng/ml。用夹心ELISA测定正常兔血清呈阴性反应;测定感染兔血清呈阳性反应,且抗原水平与感染度呈正相关;8只感染兔治疗后3个月,除2份兔血清外,其余血清均转为阴性。提示本方法优于一般抗体测定法,是一种有潜力的免疫诊断方法。     

单克隆抗体双夹心ELISA检测血吸虫循环抗原对抗血吸虫药…

应用日本务虫抗３１／３２ＫＤ单克隆抗体双夹关免疫吸附试验检测血吸虫循环抗原，用于城市急性血吸虫病经吡喹酮治疗５年后无再次感染患者的疗效考核，阳性率为１２．２％。与快速法ＥＬＩＳＡ检测循环抗原的符合率为９６．３４％。与常用检测抗体的ＩＨＡ、ＥＬＩＳＡ法平行对照，阳性率基本一致     

单克隆抗体检测循环血吸虫抗原的实验研究

将血吸虫成虫多糖抗原的单克隆抗体应用于ELISA直接法检测血清中的循环抗原.重感染兔血清35份、中感染兔血清7份及低感染兔血清10份,阳性率分别为100%,57.1%及20%,健康兔血清25份,弓形虫感染兔血清10份,均未见阳性反应.重感染兔于感染后5周OD均值明显上升,是感染前的2.95倍,以后逐周上升.中感染兔5周后,OD均值开始上升,5周和6周时的OD均值是感染前的1.27倍和3.49倍.低感染兔OD均值一直维持较低水平,至9周时OD均值才是感染前的2.56倍.结果表明,血吸虫病兔血清中的循环抗原出现时间或阳性率均与血吸虫尾蚴的感染度密切相关.     

McAb—Dot—ELISA检测血吸虫循环抗原的现场查病应用

将McAb-Dot-ELISA检测循环抗原法应用于血吸虫病疫区现场查病125例。结果：居民循环抗原阳性率为44．0％，较粪检虫卵阳性率26．4％高（P＜0．01），两者符合率为83．3％；治疗后3个月循环抗原阴转率为63．6％，较抗体阴转率10．9％（P＜0．01），提示：McAb-Dot-ELISA检测循环抗原法较粪检法检出率高，与IHA检测抗体法比较具有近期疗效考核价值。     

改良单克隆抗体Dot—ELISA检测血吸虫循环抗原

用抗趋阴极循环抗原单克隆抗体建立的Dot-ELISA检测血吸虫循环抗原显示有高度的敏感性和特异性,极少交叉反应。68份急性血吸虫病患者血清的阳性检出率为98.5%,216份慢性血吸虫病血清的阳性检出率为83.3%。225份正常人血清仅1份阳性。48例血吸虫病治愈者的阴转率为97.9%。实验性血吸虫病家兔治疗后8周,16只治愈的家兔中12只阴转。     

应用单克隆抗体Dot—ELISA检测血吸虫病循环抗原…

将抗血吸虫多肽表位的单克隆抗体ＳＪＡ１１１与辣根过氧化物酶结合，用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ直接法检４６２例确诊的血吸虫病人循环抗原，阳性率为７８．５７％（３６３／４６２）；３１例肝吸虫病人，２３例肺吸虫病人和１１８例正常人中，仅１例肺吸虫病人出现交叉反应。循环抗原的阳性检出率与每克粪便虫卵数（ＥＰＧ）呈正相关（ｒ＝０．９７５２，Ｐ〈０．０２５）。血吸虫病人经吡喹酮治疗后６月，循环抗原阴转率为７５．８６％     

夹心法ELISA检测血吸虫循环抗原的研究

用抗血吸虫成虫抗原的多克隆抗体为捕捉抗体，抗虫卵抗原的单克隆抗体ＭＧ２为标记抗体的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测血吸虫循环抗原。对慢性血吸虫病的阳性率为９５．４％；检测正常人血清２２２份，１１例假阳性，对１７例肺吸虫病人和４０例其他寄生虫病人的交叉反应率分别为１１．７％和２．５％；检测血吸虫病中度流行区人群６２２名和低感染区人群１０９９名，阳性率分别为２２．５％和４．６％。对血吸虫病疗效考核的结果表明     

抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原及疗效考核价值的初步研究

目的探讨抗重组日本血吸虫14-3-3(rSj14-3-3)的单克隆抗体检测血吸虫循环抗原对血吸虫病疗效考核的价值.方法制备纯化的抗日本血吸虫14-3-3的单克隆抗体,以纯化的兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶联免疫吸附试验(P-M-ELISA)法,分别对同批治疗前及治疗后2、4、6、12个月的血吸虫病患者和感染兔血清进行检测,并与常规检测抗体的可溶性虫卵抗原-酶联免疫吸附试验(SEA-ELISA)法比较.结果 P-M-ELISA法对治疗前血吸虫病患者检测阳性率为98.2%,而检测抗体的SEA-ELISA为95.5%.P-M-ELISA法对治愈后2、4、6、12个月血清循环抗原检测阴转率分别为17.7%、41.9%、55%、85%,而检测抗体的SEA-ELISA法分别为3.2%、6.5%、12.5%、15%.结论该法既有较好的诊断价值,又有较好的疗效考核价值.     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

抗AIB1-C单克隆抗体的制备及初步应用

目的:建立分泌抗AIB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对分泌的单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:以纯化GST-AIB1-C蛋白为免疫原,免疫BAL b/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗AIB1-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经Western-blot和免疫细胞化学法鉴定,这些McAb特异性高,亲和力强。结论:成功研制出抗AIB1-C单克隆抗体,为双抗体夹心法ELISA试剂盒的研制奠定基础。     

Isolation and specific detection of two major schistosoma gut-associated circulating antigens

目的　为探讨血吸虫肠相关循环抗原CAA与CCA诊断靶微粒上表位特异性的差别 ,并试探获取其纯化制品用于定量检测的标准系列。方法　对两组分进行了亲和层析及阴离子交换剂高压液相纯化分离 ,并应用单抗检测系统进行同相和异相交互测试。结果　Mono QHPLC梯度洗脱分离AWAj-TCA可溶组分 ,可获得一个带阳离子活性的非结合CCA - 1峰及 3个大小不等的 ,带阳离子活性的CCA - 2 ,CCA - 3,CCA - 4非结合洗脱峰 ,以及一个带阴离子活性CAA - 1洗脱峰。CAA活性峰在峰谱上与CCA - 3有部分重叠。与单抗亲和层析纯品的活性对比测定显示CCA - 1与CCA - 2为该组分的主要构成 ,但CCA - 2及CAA - 1在本实验条件下均有微量的相互杂染。同相和异相双位点ELISA的 4种组合交互检测 ,展示CCA只能在捕获与检测抗体同为抗CCA单抗的一种组合中被检示 ,而另 3种组合都只能测出CAA组分。结论　血吸虫肠相关CCA组分为一兼含两性电荷的分子混合体 ;而CAA分子上具有一个可被抗CCA单抗识别的活性表位位点 ,从而可能影响纯化分离和特异检测。     

卵黄抗体用于血吸虫循环抗原检测的可行性研究

目的探讨抗可溶性虫卵抗原（SEA）鸡卵黄抗体（Immunoglobulin Y,IgY）用于血吸虫循环抗原检测的可行性。方法以纯化的鸡抗SEA卵黄抗体为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B进行双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（S-ELISA）检测急、慢性血吸虫病病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验（SEA-ELISA）法做比较。结果S-ELISA法测得SEA浓度（y）与A450值（x）呈明显的正相关（r=0．9481,Y=459．22x-108．14）;S-ELISA法检测急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100％,慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84．4％,健康人的特异性为96．0％;两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论S-ELISA可用于血吸虫病的免疫诊断。     

Establishment and preliminary application of spermidine radioimmunoassay with 125I-labelled monoclonal antibody and solid phase antigen.

Purified anti-spermidine monoclonal antibody was labelled with radioactive iodine by the Iodogen method and spermidine-bovine serum albumin (SPD-BSA) conjugate was used to coat polystyrene beads as solid phase antigen. The new solid phase 125I-labelled spermidine radioimmunoassay (RIA) depends on the competition between spermidine in the sample and the solid phase antigen for the limited amount of 125I-labelled monoclonal antibody. The sensitivity of this assay was 10 ng/ml higher than that of liquid RIA for spermidine with 14C-labelled spermidine. The coefficients of variation (CV) within and among batches were 4% and 13% respectively. The sample-batch capacity was increased from 20 (liquid RIA with 14C-labelled spermidine) to 150-200 by using this method. Because of its simplicity, the solid phase RIA kit is very convenient for population survey. This RIA could be used to determine spermidine in saliva for the diagnosis of precancerous lesions. In a preliminary study saliva spermidine levels in different populations were measured among 130 normal subjects, 202 esophageal epithelial hyperplasia cases treated with anti-tumor B for 5 years, 207 esophageal epithelial hyperplasia cases as control, and 55 esophageal cancer patients. The levels were 1,795 +/- 1,481, 3,470 +/- 6,981, 9,753 +/- 17,641 and 18,090 +/- 21,509 ng/ml, respectively, with the saliva spermidine levels in precancerous and cancer patients being significantly higher than that of normal subjects (P less than 0.001); the level in patients treated with anti-tumor B was significantly lower than that of controls (P less than 0.001). This decreased saliva spermidine content was coincident with the 47.3% reduction of canceration rate seen in precancerous patients after a 5-year treatment with anti-tumor B.     

人去唾液酸糖蛋白受体单克隆抗体制备及其初步应用

目的 制备人去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的小鼠单克隆抗体,并应用该抗体检测ASGPR在细胞系和组织中的表达。方法 对ASGPR H1大亚基进行序列分析,选取ASGPR1全长序列制备免疫原。通过RT-PCR合成ASGPR1 cDNA,构建ASGPR1表达重组载体,在E. coli BL21中表达后纯化,获得目的抗原。应用传统融合杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体,常规检测单抗亚类和效价,竞争抑制实验鉴定单抗特异性。用流式细胞术和免疫组织化学法分别检测ASGPR在多种肝源性与非肝源性细胞系以及多种肝组织中的表达。结果 制备的单克隆抗体亚型为IgG1,效价达112 800。竞争抑制实验结果显示该单抗具有很好的ASGPR结合特异性,而且识别的肽段位于ASGPR胞外段。流式细胞术检测结果显示,ASGPR不同程度地表达于肝源性细胞系,但不表达于非肝源性细胞系。免疫组织化学检测结果显示,ASGPR专一性表达于正常肝组织和肝癌组织,在肝癌组织的表达与分化程度有关,高分化肝癌中的阳性率高于低分化肝癌(75.0% vs 28.6%,P<0.05)。结论 成功制备高特异性人ASGPR小鼠单克隆抗体,适用于用流式细胞术和免疫组织化学法检测ASGPR表达,可用于临床病理鉴定原发性肝癌与转移性肝癌。     

日本第53届实验动物学会年会介绍

[目的]建立SIVp27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。[方法]使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Westernblot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定。[结果]获得四株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类。四株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIVp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1:10240~40960。1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。[结论]成功地制备出四株SIVp27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础。     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测

目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]的分离纯化。采用FACS法测定分别经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3ScFv蛋白和Diabody[CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性。采用间接ELISA法进行抗抗CD3ScFv抗体特异性结合活性的检测。结果抗抗CD3ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3ScFv蛋白结合而不与血清发生反应。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%。结论制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。