聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD基因序列变异

目的 建立检测基因变异的聚合酶链反应（PCR）限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymophism,PFLP)法。方法 从服用拉米夫定1年以上的慢性乙肝病例中选取10例抽取血清,分别采用错配套式PCR－RFLP技术、PCR产物直接测序和重组克隆测序,检测P基因YMDD变异。结果 在10个病例中,PCR－RFLP检测到7例为野毒株、1例为混合株感染、2例为变异株;PCR产物直接测序,9例为野株、1例为变异株;对2份用PCR－RFLP法检测为非野株,而PCR测序为阴性的标本采用克隆后测序,发现均为混合株感染。结论 通过对几种检测方法的对比,认为克隆后测序的结果最精确;而从实用性和经济角度来看,采用PCR－RFLP进行初步筛查的方法具有更大的意义。值得推广。     

VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型( EV71)非柯萨奇病毒A组16型( CoxA16)手足口病( HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16 HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型( Cox-A10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。     

PCR-SSCP法检测乙型肝炎病毒前C区基因变异

为探索一种快速，简便检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区基因变异的方法，用聚合酶链反应（PCR）技术扩增94例乙肝患者血清HBV前C区基因片段，阳性扩增产物用单链构象多态性（SSCP）法进行检测，对具有不同特征性电泳图谱的PCR产物再以直接测序法加以核定，以辨别不同图谱与野生株，变异株或野生株，变异株混合感染之间的关系。结果显示：有86例患者HBV前C区PCR扩增阳性，SSCP法检测发现有3种常见的特征性电泳图谱，测序后证实，它们分别代表了野生株，变异株（nt1896位G→A）及野生株，变异株混合感染的SSCP图谱；在某些变异株图谱中，尚可见其它位点也存在变异，其中以nt1899位G→A突变最为常见，提示：以PCR-SSCP技术检测HBV前C区变异具有敏感性高，特异性强，简单，快捷，价廉等优点，而且特别适用于大样本的筛检，因此有应用价值，值得推荐。     

PCR产物直接测序检测乙型肝炎病毒耐药变异位点

目的研究采用PCR产物直接测序技术在乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异位点检测的特异性和实用性。方法 166例经过核苷类似物治疗至少2年以上的慢性乙肝患者,提取血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增,将所得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测,阳性PCR产物直接测序。对测序成功的样本进行耐药变异分析。结果 166例中有120例HBV DNA扩增电泳产物阳性,测序确定基因耐药变异位点有40例(24.1%,40/166);其具体分布为:L180M和M204V/I均变异17例(42.5%,17/40)、M204V/I变异lO例(25%,10/40)、N236T变异8例(20%,8/40)、L180M变异3例(7.5%,3/40)、A181V/T变异1例(2.5%,1/40)、A181V/T和N236T变异1例(2.5%,1/40)。120例患者测序确定基因耐药未测出变异位点有80例(66.66%,60/120)例。结论本院核苷类似物治疗2年以上患者,控制病毒疗效并不佳,有24%患者出现基因耐药。PCR产物直接测序法是目前检测HBV耐药变异的一种较好的方法,可用于专科医院临床检测。     

PCR产物直接测序检测乙型肝炎病毒耐药变异位点

摘要：目的研究采用PCR产物直接测序技术在乙型肝炎病毒（HBV）耐药变异位点检测的特异性和实用性。方法166例经过
核苷类似物治疗至少2年以上的慢性乙肝患者,提取血清HBV DNA,采用巢式PCR扩增,将所得的PCR产物进行琼脂糖电泳
检测,阳性PCR产物直接测序。对测序成功的样本进行耐药变异分析。结果166例中有120例HBV DNA扩增电泳产物阳性,
测序确定基因耐药变异位点有40例（24.1%,40/166）;其具体分布为：L180M和M204V/I均变异17例（42.5%,17/40）、M204V/I
变异10例（25%,10/40）、N236T变异8例（20%,8/40）、L180M变异3例（7.5%,3/40）、A181V/T变异1例（2.5%,1/40）、A181V/T和
N236T变异1例（2.5%,1/40）。120例患者测序确定基因耐药未测出变异位点有80例（66.66%,60/120）例。结论本院核苷类似
物治疗2年以上患者,控制病毒疗效并不佳,有24%患者出现基因耐药。PCR产物直接测序法是目前检测HBV耐药变异的一种
较好的方法,可用于专科医院临床检测。
     

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的:了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性(SNP)检测上的差别.方法:对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应(PCR)扩增,分别对其产物进行直接测序和克隆测序.结果:在样本的检测中, PCR产物直接测序法所测序列与43～60 bp以后克隆测序相同;检出一个突变位点并与GenBank( DQ012938)发表序列一致.结论:PCR 产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法,但前者不仅特异性强,敏感度高,而且比克隆测序方法更为快速简便,节省材料.     

PCR直接测序法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒DNA

目的 探索检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)DNA的有效手段。方法 采用HPV通用引物对宫颈癌标本巾的HPVL1区基因序列进行PCR扩增，根据PCR产物序列分析对HPV分型。结果 50例宫颈癌组织HPVDNA检出率为78％，其中HPV16和HPV18型混合感染最多见。检测出1例HPV58型，其LI区基因序列与德国标准株58型比对，未发现碱基变异。结论 PCR直接测序法是对宫颈癌组织中HPV检测和分型的一种有效方法，并可检测到HPV少见的特殊类型，同时也能提供已知的HPV型别的突变信息。     

变性高效液相色谱法检测乙型肝炎病毒YMDD基序的变异

目的 建立变性高效液相色谱(DHPLC)检测HBV DNA聚合酶活性区酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)基序变异的方法.方法 分别采用荧光PCR法和DHPLC法检测61例慢性乙型肝炎(CHB)患者经拉米夫定治疗1年后HBV YMDD基序变异,并经基因测序法验证.结果 共检出10例野生型、5例DNA聚合酶活性区酪氨酸-异亮氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YIDD)完全突变型、2例DNA聚合酶活性区酪氨酸-缬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YVDD)完全突变型,3例YMDD与YIDD混合突变型,1例YMDD与YVDD混合突变型,2种方法检出结果一致;21例PCR产物经过基因测序法得到证实. 结论 PCR结合DHPLC检测YMDD基序变异,经济便捷,适用于筛查CHB患者的YMDD基序变异.     

实时荧光PCR检测乙肝病毒YMDD变异的临床应用

目的 :探讨实时荧光 PCR检测 HBV YMDD变异价值。方法 :比较实时荧光 PCR法与 PCR产物直接测序的结果 ,以评价该方法的准确性 ,同时测定 10 3例拉米夫定治疗不同时期的患者血清 ,分析各时期的变异率及临床资料。结果 :19例标本的实时荧光 PCR结果与 PCR产物测序结果完全一致。10 3例患者中 13例发生 YMDD变异 ,治疗 7个月～ 12个月 YMDD变异率为 15 .2 % (5 /33) ,治疗 1a以上 YMDD变异率为 33.3% (8/2 4 )。变异患者与非变异患者体内的病毒量差异无显著性 ;变异患者 AL T异常发生率高于非变异患者 ,但升高程度不如部分非变异患者 ;变异患者保护性抗体的出现率较低。结论 :实时荧光 PCR检测 YMDD变异是一种准确、灵敏、经济、简便、快速并适合大批量标本检测的方法     

PCR直接测序法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒DNA

目的 探索检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)DNA的有效手段。方法 采用HPV通用引物对宫颈癌标本中的HPVL1区基因序列进行PCR扩增,根据PCR产物序列分析对HPV分型。结果 50例宫颈癌组织HPVDNA检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染最多见。检测出1例HPV58型,其L1区基因序列与德国标准株58型比对,未发现碱基变异。结论 PCR直接测序法是对宫颈癌组织中HPV检测和分型的一种有效方法,并可检测到HPV少见的特殊类型,同时也能提供已知的HPV型别的突变信息。     

巢氏PCR—RFLP和多重PCR检测HBV基因型、基因亚型方法的比较

目的:建立HBV基因型和亚型的分型方法,并分析相关的两种方法特异性和敏感性。方法:采用型特异性引物的巢氏PCR-RFLP和六种主要的HBV型特异性引物和亚型特异性引物的多重PCR方法,分别检测了100例患者标本。结果:两法不一致率为50%(27/54)。型特异性引物巢氏PCR-RFLP法检测出B基因型41例(41%),C基因型25例(25%),B C基因型34例(34%),B j亚型3例(7.3%),Ba亚型为38例(92.7%),Cs亚型为21例(84%),Ce亚型为3例(12%),1例C型未分出亚型(4%)。多重PCR法检出B型18例(33.3%),C型7例(13%),B C混和型5例(9.3%),B2亚型2例(11%),C1亚型2例(28.5%)。巢氏PCR-RFLP法型检出率100%亚型检出率98.5%,多重PCR法型检出率55.6%,亚型检出率仅为16%,前者高于后者(P<0.05)。结论:巢氏PCR-RFLP鉴定HBV基因型、基因亚型较多重PCR敏感性高,重复性好,但耗时长,费用高。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

耐拉米夫定乙肝病毒变异株的人工构建及其限制性片段长度多态性分析

目的　建立简便易行的筛检常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株的方法。方法通过PCR定向点突变 ,构建最常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株 (YMDD变异株 ) ,并建立相应的错配PCR结合限制性片段长度多态性分析 (RFLP)检测此变异株。结果PCR成功引入点突变 ,构建了YMDD变异株的克隆 ,同时错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可有效区分YMDD变异株和HBV野毒株。结论采用PCR的方法可诱导定向点突变 ,错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可用于筛检临床常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株 (YMDD变异株 ) ,为临床监测提供了一种很好的模式。     

乙型肝炎病毒前S1、前S2抗原及e抗原与病毒DNA之间的相关分析

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）血清学标志物及HBV DNA之间的相关性。方法 应用定量PCR内标法检测HBV DNA,筛选出100例未经干扰素和核苷（酸）类似物治疗、丙氨酸氨基转移酶（ALT）／天冬氨酸氨基转移酶（AST）正常且HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者。用微粒子酶免分析法、ELISA方法检测乙肝血清学标记物。筛选出40名健康人作为质控对照。结果 HBV DNA阳性乙肝患者：（1）乙肝e抗原（HBeAg）阳性率为75％;乙肝e抗体（抗-HBe）阳性率25％;乙肝前s1抗原（PreS1-Ag）阳性率为69％;乙肝前S2抗原（PreS2-Ag）阳性率为77％;（2）75例HBeAg阳性患者中PreS1-Ag阳性54例,PreS2-Ag阳性60例;25例抗-HBe阳性患者中PreS1-Ag阳性14例,PreS2-Ag阳性17例。PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性率在两种情况下的差异均无统计学意义（均P〉0．05）;（3）HBeAg阳性时,PreS1-Ag、PreS2-Ag均阴性的阴性率（8％）低于抗-HBe阳性时的阴性率（28％）,差异有统计学意义（P〈0．05）;（4）PreS1-Ag与PreS2-Ag同为阳性、阴性的72例。结论 慢性乙型肝炎患者HBeAg、PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性与HBV—DNA阳性的符合率较高。PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性率与HBeAg的阳性无明确相关。PreS1-Ag、PreS2-Ag阴性率与抗-HBe阳性有较好的相关性。     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ＣＰ）部分缺失的真核表达质粒。方法　利用线性化的、从ＣＰ上游顺 序开始且含完整转录单元的ＨＢＶ 基因克隆（Ｐ３．８Ｉ质粒）为工具,采用分子克隆、人工定点突变、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ,鉴定和测 序分析等技术构建目的载体。结果　成功构建了ＨＢＶ全基因ＣＰ ２０／２１个ｂｐ缺失（ｎｔ １７４８／１７４７－１７６７）和ＣＰ２０／２１个ｂｐ 缺失＋１８９６热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ序列分析证实。结论　此重组真核表达质粒构建可为 体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

HDV阳性乙型病毒性肝炎血清和肝内HBV DNA状态的研究

本文报告15例HDV(+)乙型肝炎患者血清和肝内HBV DNA的状态和血清中HBVM的检测结果,并与13例HDV(-)者进行比较。结果发现:血清HBsAg在HDV(+)组有8例滴度≤1:4,其中5例短暂(-),1例住院2天内始终(-),HDV(-)组未见类似现象。HDV(+)和(-)组血清和肝内HBV DNA检出率分别为7/15例(46.7％)与3/12例(25.0％)和7/15(46.7％)与8/13例(61.5％),两者无差异。但HDV(+)组肝内HBV DNA在肝细胞胞浆内分布3例呈稀疏形式,2例着色浅淡,表明HBV复制受限,HDV对HBV可能有抑制现象。本文也具有部份HDV(+)患者肝内HBV DNA复制活跃,3例肝和血清HBV DNA同时阳性,这种结果的不一致可能与HDV感染处于不同阶段有关。     

IL-8基因多态性对慢性HBV感染者血清IL-8水平的影响

目的 探讨IL-8基因多态性对血清IL-8水平的影响以及IL-8基因多态性在慢性HBV感染发病机制中的可能作用.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测60例慢性HBV感染者和60例健康人群IL-8-251A/T位点多态性,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清中IL-8的水平.结果 慢性HBV感染者和健康对照者间 IL-8-251A/T多态性位点各基因型频率和等位基因频率相比,差异有统计学意义(P<0.05).基因型为AA型、TA型的慢性HBV感染者其血清IL-8水平显著高于基因型为TT型的慢性HBV感染者(P<0.01)和所有基因型的健康对照(P<0.01).结论 IL-8-251A/T基因多态性与慢性HBV感染者血清IL-8水平有密切关系,提示IL-8-251A/T基因多态性可能会影响慢性HBV感染中患者的转归起重要的作用.     

PCR检测HBV DNA与HBV血清标志物常见模式和Pre-S2相互关系研究

目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV)DNA与六种常见HBV血清免疫学标志物模式、前S2 蛋白抗原 (Pre -S2 )之间的相互关系及其临床检测意义。方法　采用PCR法对HBVDNA、ELISA法对HBV血清免疫学标志物、Pre -S2 同时进行检测。结果　1484例六种常见模式HBVDNA阳性率依次为 89 8% >5 5 6 % >2 1 8% >7 5 % >7 1% >6 8% ,即模式 (1) >(3) >(2 ) >(5 ) >(6 )>(4) ;而HBV血清免疫学标志阳性例数依次为 (2 ) >(1) >(3) >(5 ) >(4) >(6 )。 (2 )、(3)种模式HBVDNA与Pre S2阳性率比较P <0 0 1,其余 (1)、(4)～ (6 )种模式HBVDNA与Pre-S2 阳性检出率无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论　HBV血清免疫学标志物、Pre -S2、HBVDNA的检测 ,三者缺一不可 ,ELISA法检测HBV血清免疫学标志物、Pre -S2 ,只是HBV的表型指标 ,提供HBV感染的间接证据。而PCR -HBVDNA的检测是HBV感染与否的直接证据。因此它们各自有其独特的临床检测意义。     

HBV YMDD变异与HBV-DNA水平的关系

目的 观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎病毒YMDD变异的产生与血清HBV-DVA水平的关系.方法 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者106例,平均疗程32月(12～48月),治疗前及治疗中每4～6月采血,用荧光实时PCR定量检测HBV-DNA,采用错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析的方法检测HBVYMDD变异.分析出现YMDD变异组与非变异组治疗前HBV DNA水平差异.结果 YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异(P＜0.01).结论 慢性乙型肝炎患者治疗前血清病毒载量水平越高,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异,且产生时间越早.血清病毒载量可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标.     

桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布研究

目的:研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点,为本地区乙型肝炎的防治提供依据.方法:采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型.结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型,序列分型B2 104例,占86.7％;B4 1例,占0.8％;B5 1例,占0.8％,其中14例未分出亚型,占11.7％.结论:桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主,其次为B4、B5,未发现B1、B3、B6亚型.