大黄素抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞自噬的分子机制

目的:探讨大黄素(emodin)对饥饿诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)自噬的调节作用及其可能机制。方法:首先,用Western blot检测大黄素对Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)饥饿诱导的细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅰ/Ⅱ表达水平的影响;其次,用红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(redfluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,RFP-LC3)质粒瞬时转染NRK-52E细胞,以HBSS(1 mL)联合巴弗洛霉素A1(10 nmol·L^-1)处理,予大黄素(10 μmol·L^-1)干预后,荧光显微镜下观察RFP-LC3荧光颗粒的变化;然后,以哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L^-1)干预,观察阻断mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬作用的影响;最后,通过诱导内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR(DEP domain-containing mTOR-interacting protein)过表达,进一步评估mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬的影响。结果:HBSS饥饿可诱导NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白高表达,大黄素干预后可逆转HBSS诱导的LC3Ⅱ蛋白表达增加;HBSS联合巴弗洛霉素A1处理后可引起RFP-LC3荧光颗粒数目增多,大黄素干预后可抑制其数目的增加;雷帕霉素与大黄素、HBSS联合干预后,雷帕霉素可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白表达水平;而过表达内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR同样可以阻断大黄素对LC3Ⅱ蛋白表达的抑制作用。结论:大黄素可以抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞LC3Ⅱ蛋白表达和自噬活化,其阻断自噬的作用可能是通过mTOR信号通路介导的。     

大黄素诱导自噬改善顺铂导致肾小管细胞损伤机制探索

目的：观察大黄素对顺铂所致的肾小管上皮细胞（NRK-52E）损伤的影响,探讨其可能分子调节机制。方法：观察大黄素对顺铂所致NRK-52E细胞形态学改变的影响;采用Western Blot方法检测顺铂单独处理和加入大黄素共同处理细胞后,凋亡相关蛋白Caspase-3和cleaved Caspase-3的表达情况;用大黄素干预细胞不同的时间点,观察微管相关蛋白1轻链3（LC3）II/I的表达和pmRFP-LC3质粒转染细胞后荧光颗粒的变化情况,同时观察雷帕霉素处理细胞不同时间点后LC3-II/I的表达情况及其对顺铂环境下细胞形态学改变的影响,并观察大黄素对自噬上游通路AMPK的活化和mTOR信号的影响。结果：顺铂可以诱导NRK-52E细胞出现形态学改变,大黄素能够改善顺铂导致的变化。另外,大黄素干预可以下调顺铂导致的cleaved Caspase-3蛋白表达的增多;大黄素处理细胞不同时间点LC3-II/LC3-I的比值明显上升,pmRFP-LC3转染观察到大黄素处理细胞后自噬颗粒明显增多。同时雷帕霉素处理细胞后LC3-II/LC3-I的比值明显上升,其与顺铂共同干预能明显改善顺铂诱导的细胞凋亡;大黄素干预时间的延长,p-mTOR蛋白表达明显下调,p-AMPK的表达明显上调。结论：大黄素可以改善顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡,其作用机制可能是通过调节AMPK/mTOR信号通路诱导自噬来发挥肾保护作用。     

葛根素调节AMPK-mTOR信号通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究

目的探讨葛根素通过腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)-Unc-51样激酶1(Ulk1)通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组,即假手术组、模型组及葛根素低、高剂量(50、100 mg/kg)组。各组大鼠连续给药7 d,末次给药30min后,采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血1.5 h再灌注24 h后,进行神经功能评分,TTC染色观察脑梗死体积,电镜观察自噬小体的形成,Western blotting法检测海马组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62、AMPK、p-AMPK、m TOR、p-mTOR、Ulk1、p S757-Ulk1蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分显著增加,脑梗死体积明显增大,自噬小体增多,LC3-II/LC3-I显著增加,p62蛋白表达水平显著降低,p-AMPK表达水平显著升高,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著降低。与模型组比较,葛根素各组大鼠的神经功能损伤明显改善,脑梗死体积减小,自噬小体减少,LC3-II/LC3-I显著降低,p62蛋白表达水平显著升高,p-AMPK蛋白表达水平显著降低,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著升高。结论葛根素可能通过调控AMPK-m TOR-Ulk1信号通路抑制自噬的过度发生,从而减轻脑缺血再灌注损伤的发生。     

EGb761对视神经损伤后视神经节细胞自噬的影响

目的:观察银杏提取物EGb761对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞自噬活性及自噬流的影响,并探讨其作用机制。方法:将48只SD大鼠随机分为EGb761组和对照组,分别给予EGb761(150mg/kg·d)和0. 9%氯化钠注射液灌胃,均每天1次,直到处死。分别于损伤后第7天、第14天取材,采用免疫组化检测2组视网膜神经节细胞自噬相关蛋白LC3B、自噬标记蛋白p62及自噬基因Beclin-1及m TOR通路蛋白p-m TOR、p-S6表达水平,腺病毒GFP-m RFP-LC3荧光瞬时转染技术检测自噬流表达。结果:与对照组相比,EGb761组LC3B表达水平升高,p62、p-m TOR和p-S6蛋白表达水平均下降(均P 0. 05); 2组Beclin-1差异无统计学意义(P 0. 05); 2组GFP和m RFP荧光点数比较,EGb761组的红点多于对照组,黄点少于对照组(均P 0. 05)。结论:EGb761能够促进大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞自噬流,其机制可能与促进m TOR信号通路中的相关蛋白表达有关。     

甘草查尔酮A通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肾癌细胞自噬的研究

研究甘草查尔酮A(licochalcone A,LCA)对肾癌细胞自噬的影响,并探讨其对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路的调控作用。实验以肾癌细胞系786-O,769-P细胞为研究对象,采用MTT检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移和侵袭;吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞自噬状态;Ad-GFP-LC3转染实验观察细胞中绿色点状聚集的自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白的表达,PI3K/Akt/m TOR信号通路的变化,以及抑制该通路后检测诱导自噬的变化。结果表明,LCA抑制细胞增殖呈时间-浓度依赖性,同时剂量依赖性地抑制细胞迁移和侵袭;LCA能够诱导细胞内酸性自噬泡和自噬小体的增多;LCA可明显诱导LC3-Ⅱ,beclin 1,Atg5蛋白表达,降低p62蛋白表达,同时减少Akt,m TOR的磷酸化。使用PI3K/Akt抑制剂(LY294002)以及m TOR抑制剂(rapamycin,Rap)可促进LCA诱导自噬的发生。以上结果提示,LCA通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路进而抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导肾癌细胞发生自噬。     

加味五虎追风散保护神经元的作用机制研究

目的:探讨加味五虎追风散对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)大鼠模型线粒体-ATP-mTOR信号通路和多巴胺(DA)能神经元自噬的影响。方法:将120只大鼠随机分为空白对照组、模型组、加味五虎追风散组和雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂组4组,每组30只。空白对照组正常饲养,其他组均采用颈、背部交替皮下注射鱼藤酮法制备大鼠PD模型,加味五虎追风散组和m TOR抑制剂组分别以加味五虎追风散溶液和雷帕霉素溶液灌胃。干预3周后提取大鼠中脑和纹状体,采用线粒体呼吸测定仪测定线粒体呼吸控制比(RCR),采用荧光素-荧光素酶发光法测定线粒体ATP合成酶活力;采用免疫蛋白印迹实验测定磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)表达。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因表达、线粒体RCR、ATP合成酶活力及p-mTOR表达降低,LC3B蛋白表达升高(P0.05或P0.01);与模型组比较,加味五虎追风散组和m TOR抑制剂组TH表达、线粒体RCR、ATP合成酶活力及LC3B蛋白表达明显升高,p-m TOR表达明显降低(P0.05或P0.01)。结论:加味五虎追风散能够通过线粒体-ATP-mTOR途径上调DA能神经元自噬,发挥神经元保护作用。     

虫草菌丝抑制自噬相关AMPK/ULK1信号活性改善肾小管上皮细胞衰老的分子机制

为了探讨虫草菌丝(mycelium of Cordyceps sinensis,MCs)改善D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的肾小管上皮细胞衰老的作用和分子机制,将体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常组(normal group,N),模型组(D-gal model group,D),低剂量MCs组(low dose of MCs,L-MCs),中剂量MCs组(medium dose of MCs,M-MCs),高剂量MCs组(high dose of MCs,H-MCs),分别进行不同的干预。具体而言,N组加入1%胎牛血清(fetal bovine ser-um,FBS)1 m L;D组加入100 mmol·L~(-1)D-gal;L-MCs组加入100 mmol·L~(-1)D-gal+20 mg·L~(-1)MCs;M-MCs组加入100 mmol·L~(-1)D-gal+40 mg·L~(-1)MCs;H-MCs组加入100mmol·L~(-1)D-gal+80 mg·L~(-1)MCs。在干预后的24或48 h,首先,观察D-gal对NRK-52E细胞klotho,P27,P16蛋白表达水平,β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色以及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/不协调的51类激酶1(uncoordinated 51-like kinase 1,ULK1)信号活性的影响;其次,观察MCs对NRK-52E细胞增殖活性的影响;最后,观察MCs对D-gal诱导的NRK-52E细胞klotho,P27,P16蛋白表达水平,SA-β-gal染色以及哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和AMPK/ULK1信号活性的影响。结果表明,对于NRK-52E细胞,D-gal能引起衰老,并诱导磷酸化AMPK(phosphorylated-AMPK,p-AMPK)和磷酸化ULK1(phosphorylated-ULK1,p-ULK1)蛋白高表达,激活AMPK/ULK1信号通路;中、高剂量MCs与D-gal联合干预能明显改善klotho,P27,P16蛋白表达水平和SA-β-gal染色程度,具有抗细胞衰老的作用;此外,中、高剂量MCs与D-gal联合干预能明显改善LC3,p-AMPK,p-ULK1蛋白表达水平,抑制AMPK/ULK1信号活性,提高自噬水平。总之,对于D-gal诱导的肾小管上皮细胞衰老模型,MCs在体外有抗衰老的作用,并且,通过抑制自噬相关AMPK/ULK1信号活性而干预其衰老进程。这可能是MCs抗肾小管上皮细胞衰老的新的分子机制。     

甘草查尔酮A通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肾癌细胞自噬的研究北大核心CSCD

研究甘草查尔酮A（licochalcone A,LCA）对肾癌细胞自噬的影响,并探讨其对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）信号通路的调控作用。实验以肾癌细胞系786-O,769-P细胞为研究对象,采用MTT检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移和侵袭;吖啶橙（acridine orange,AO）染色观察细胞自噬状态;Ad-GFP-LC3转染实验观察细胞中绿色点状聚集的自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白的表达,PI3K/Akt/m TOR信号通路的变化,以及抑制该通路后检测诱导自噬的变化。结果表明,LCA抑制细胞增殖呈时间-浓度依赖性,同时剂量依赖性地抑制细胞迁移和侵袭;LCA能够诱导细胞内酸性自噬泡和自噬小体的增多;LCA可明显诱导LC3-Ⅱ,beclin 1,Atg5蛋白表达,降低p62蛋白表达,同时减少Akt,m TOR的磷酸化。使用PI3K/Akt抑制剂（LY294002）以及m TOR抑制剂（rapamycin,Rap）可促进LCA诱导自噬的发生。以上结果提示,LCA通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路进而抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导肾癌细胞发生自噬。     

吴茱萸碱激活结肠癌细胞自噬抑制其增殖的研究

目的探讨吴茱萸碱(evodiamine,Evo)对结肠癌HCT-116细胞自噬、增殖的影响及其可能的分子机制。方法 CCK-8法检测Evo对HCT-116细胞增殖的影响;Evo(3、6μmol/L)处理48 h后,MDC法检测细胞内自噬小泡的数量,DHE法检测细胞内活性氧(ROS)的量,Western blotting法检测细胞自噬相关蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路相关蛋白的表达;Evo(6μmol/L)分别与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK共同作用48 h后,Western blotting法检测细胞内自噬及凋亡相关蛋白的表达。结果与对照组比较,Evo对HCT-116细胞呈现浓度依赖性的增殖抑制作用;Evo(3、6μmol/L)使HCT-116细胞内的ROS量升高、自噬小泡数量增加、自噬相关蛋白LC3表达增加、p62表达降低、p-AMPK及m TOR表达增加;Evo与自噬抑制剂联合给药后,细胞内LC3蛋白表达减少,而有活性的Caspase-3表达增加,Evo与凋亡抑制剂联合给药后,细胞内LC3表达增加,而有活性的Caspase-3表达被抑制。结论 Evo能够通过AMPK/m TOR通路激活自噬、抑制HCT-116细胞增殖,且细胞自噬与凋亡呈现互补作用。     

肺积宁方影响Lewis肺癌细胞增殖和自噬的作用机制研究

目的:研究肺积宁方对Lewis肺癌细胞增殖和自噬的影响及相关信号通路的探讨。方法:选用不同浓度的肺积宁方(FJND)提取物作用于体外培养的Lewis肺癌细胞,MTT法检测FJND对Lewis细胞增殖的抑制作用;通过GFP-LC3自噬定位观察细胞自噬情况;蛋白免疫印迹法检测不同浓度FJND作用Lewis细胞后,Beclin-1蛋白、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白表达;和m TOR,AKT,p-AKT相关蛋白表达情况。结果:FJND在3.12 mg/m L抑制Lewis细胞增殖作用最强,Beclin-1蛋白、Atg5蛋白表达及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显高于对照组;对m TOR,AKT,p-AKT蛋白抑制作用强于对照组。结论:肺积宁方抑制细胞增殖和诱导自噬,可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路发挥作用。     

基于mTOR信号通路研究黄芩苷对对乙酰氨基酚诱导肝损伤后肝修复作用

目的 探讨黄芩苷对对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）诱导的肝损伤后肝再生的作用及机制。方法 C57BL/6小鼠随机分成对照组、模型组和黄芩苷（40、80 mg/kg）组,小鼠ip APAP（300 mg/kg）1 h后ig黄芩苷,ip APAP 24 h或48 h后检测血清中天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）活性;通过苏木素-伊红（HE）染色法观察肝脏的病理变化;采用qRT-PCR检测肝脏组织中肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）mRNA表达;通过BeyoClick^™ EdU法检测肝脏组织细胞增殖情况;通过免疫组化染色法观察肝脏组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞数量;通过Western blotting检测肝脏组织中PCNA、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p62、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain,LC3B）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR）和p-S6蛋白的表达。给予mTOR抑制剂雷帕霉素后,观察雷帕霉素对黄芩苷促进肝修复作用的影响。结果 黄芩苷可以显著减少APAP诱导的急性肝损伤小鼠的肝坏死面积（P＜0.05、0.01）,上调肝脏HGF、EGF mRNA表达和PCNA、Cyclin D1、p62、p-S6、p-mTOR蛋白表达（P＜0.05、0.01）,下调LC3B蛋白表达（P＜0.05、0.01）,从而激活mTOR信号通路,促进APAP诱导的肝损伤后肝再生。此外,黄芩苷对肝再生的促进作用在给予mTOR抑制剂雷帕霉素后减弱（P＜0.05）。结论 黄芩苷能够通过激活mTOR信号通路,促进肝细胞增殖,并抑制其介导的自噬,从而促进肝修复。     

健脾消癌方对结肠癌细胞中Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨健脾消癌方含药血清对人结肠癌HCT116细胞蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。方法:以15%健脾消癌方含药血清处理结肠癌HCT116细胞,采用Transwell侵袭实验检测HCT116细胞迁移、侵袭作用,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测HCT116细胞中Akt,磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),mTOR,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR),核糖体S6蛋白激酶(S6K1),磷酸化核糖体S6蛋白激酶(p-S6K1),真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP1),磷酸化真核细胞始动因子4E结合蛋白(p-4EBP1)等蛋白的表达,正常血清组设立相同浓度正常血清组(15%),10%胎牛血清组(FBS)。结果:与正常血清组比较,健脾消癌方含药血清组迁移细胞数与侵袭细胞数均显著降低(P 0. 01);与正常血清组比较,Akt蛋白表达无明显下调,p-Akt蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,mTOR蛋白表达无明显下调,p-mTOR蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,S6K1蛋白表达无明显下调,p-S6K1蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,4EBP1蛋白表达无明显下调,p-4EBP1蛋白表达显著下调(P 0. 01)。结论:健脾消癌方抗结肠癌复发转移的机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路的激活有关。     

Ginsenoside Rg1, a major active component isolated from Panax notoginseng, restrains tubular epithelial to myofibroblast transition in vitro

The medicinal herb, Panax notoginseng, has been used for thousands of years in traditional Chinese medicine and possesses anti-fibrosis properties. Epithelial-myofibroblast transition (EMT) plays an important role in renal tubulointerstitial fibrosis. The present study was designed to examine whether ginsenoside Rg1, a major active component isolated from Panax notoginseng, has an ability to block this phenotypic transition in rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E) induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). The morphology of tubular epithelial-myofibroblast transition was observed through light microscope and transmission electron microscopy. α-SMA and E-cadherin are two markers of tubular epithelial-myofibroblast transition, their protein expressions were assessed by immunohistochemistry and western blot analysis. Gene expression of α-SMA as well as the two major extracellular matrix components collagen I and fibronectin was measured by real-time PCR analysis. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to quantitatively detect collagen I and fibronectin in the supernatant. Our results revealed that ginsenoside Rg1 obviously blocked morphologic transformation in NRK-52E induced by TGF-β1. Meanwhile, ginsenoside Rg1 inhibited the expression of α-SMA and the loss of E-cadherin, subsequently decreased the levels of collagen I and fibronectin in a dose-dependent manner. In addition, western blot analysis indicated that ginsenoside Rg1 inhibited the expression of P-ERK1/2 in NRK-52E induced by TGF-β1. These results suggest that ginsenoside Rg1 can restrain the process of EMT maybe via suppressing the expression of P-ERK1/2 in vitro.     

活血消瘿方含药血清调控AMPK/mTOR通路对脂多糖诱导的甲状腺滤泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨活血消瘿方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞(TFECs)自噬和凋亡的影响以及作用机制。方法 光学显微镜观察分离培养的SD大鼠TFECs细胞的形态;免疫荧光染色鉴定TFECs中特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)。取对数生长期的TFECs,分为对照组、LPS组、含药血清组、含药血清+compound C(AMPK抑制剂)组、含药血清+MHY1485(mTOR激活剂)组,MTT法检测各组细胞活力;绿色荧光蛋白(GFP)标记质粒转染检测各组细胞自噬小体变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡;western blot检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3II、Beclin1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果 光学显微镜观察显示,TFECs形态为梭形、形态均一,且可成簇生长。免疫荧光结果显示,TFECs细胞质中可见较强的Tg荧光染色。与对照组比较,LPS组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著降低,炎性因子IL-6 、TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著升高(P< 0.05);与LPS组比较,含药血清组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著升高,炎性因子IL-6 、 TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著降低(P< 0.05);与含药血清组比较,含药血清+compound C组、含药血清+MHY1485组TFECs中相应指标与上述趋势相反。结论 活血消瘿方含药血清对LPS诱导的TFECs自噬的促进作用及细胞凋亡的抑制作用可能与激活AMPK/mTOR通路有关。     

吴茱萸碱作用mTOR信号通路引起胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究

吴茱萸碱(evodiamine)是中药吴茱萸最主要的具有抗肿瘤活性的生物碱之一,研究初步探讨吴茱萸碱作用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制,为其抗肿瘤机制的探索及胃癌临床治疗奠定基础。采用MTT法观察吴茱萸碱单独作用对SGC-7901细胞及对人外周血单个核细胞(PBMCs)的细胞毒效应。Real-time PCR,Western blot分别检验吴茱萸碱单独或联合胱天蛋白酶抑制剂(z-VAD-fmk)作用后,mTOR,p70S6K和4EBP1基因表达以及mTOR和p-mTOR蛋白表达。结果表明,吴茱萸碱抑制SGC-7901细胞增殖存在时间剂量依赖性,且对人PBMCs无细胞毒作用。吴茱萸碱及联合z-VAD-fmk分别作用后,细胞变圆,漂浮于培养基中;与对照组比较,2种处理方法均能抑制mTOR,p70S6K和4EBP1基因表达,存在显著性差异,且与吴茱萸碱单独作用比较,联合z-VAD-fmk作用对基因表达抑制率加强;Western blot结果显示吴茱萸碱可以抑制mTOR和p-mTOR蛋白的表达无论是否有z-VAD-fmk的参与,且z-VAD-fmk阻断胱天蛋白酶作用后,抑制率增强。综上说明吴茱萸碱可能通过mTOR信号通路促进胃癌SGC-7901细胞凋亡。     

中介素通过抑制内质网应激保护缺氧复氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞

目的探讨中介素(intermedin,IMD)通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)途径的细胞凋亡,发挥对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的保护机制。方法 NRK-52E细胞随机分为对照组;H/R组;空质粒(H/R+p IRES2)组;IMD(H/R+IMD)组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡;Realtime PCR法和Western-blot法分别检测ERS相关经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12在mRNA及蛋白水平的表达;ER特异性荧光染料Dapoxyl用于观察ER形态变化。结果 MTT结果显示,H/R组NRK-52E细胞存活率较对照组明显下降,而IMD转染后细胞存活率提高;肾小管上皮细胞NRK-52E经H/R处理后出现凋亡,细胞凋亡率显著增加,同时H/R可导致ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均显著上调;IMD转染后可显著降低NRK-52E细胞凋亡,细胞凋亡率降低,ERS途径经典分子GRP78、CHOP、Caspase 12的mRNA和蛋白表达均明显下降。内质网染色结果显示,H/R可以导致内质网结构受损,Dapoxyl染料聚集,荧光强度加强,内质网颗粒感增强,荧光颗粒分布不均、浓集,并有空泡;IMD转染后内质网结构受损减轻。结论大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E H/R损伤过程中可能存在ERS凋亡途径的活化,IMD可以通过抑制ERS相关的凋亡信号通路,从而减少肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾脏IRI。     

迷迭香酸通过AMPK/mTOR通路减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤研究

目的 探讨迷迭香酸对新生大鼠缺血缺氧脑损伤（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）的影响,及其对单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的调控作用,初步探讨其脑保护机制。方法 取7 d龄SD新生大鼠,随机分为对照组、模型组、迷迭香酸（300 mg/kg）组、AMPK/mTOR激动剂MT6378（10 mg/kg）组、AMPK抑制剂GSK-690693（30 mg/kg）组和迷迭香酸（300 mg/kg）+MT6378（10 mg/kg）组,每组20只。建立HIE模型,给予相应药物进行干预,采用TTC染色法检测大鼠脑梗死情况;透射电镜（TEM）观察大鼠海马神经元结构损伤及自噬状况;免疫荧光法检测大鼠海马神经元自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）阳性表达;TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡率;免疫组化法检测大鼠海马神经元磷酸化AMPK（p-AMPK）阳性表达;Western blotting检测大鼠海马组织活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51样自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1,Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠脑梗死严重,海马神经元结构损伤及自噬空泡形成较多,细胞自噬及凋亡水平升高,AMPK/mTOR通路活化（P<0.05）。与模型组相比,迷迭香酸组及GSK-690693组大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬减弱,AMPK/mTOR通路被抑制（P<0.05）;MT6378组海马组织AMPK/mTOR通路进一步激活,大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬进一步加重（P<0.05）;MT6378可逆转迷迭香酸的上述作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可能通过抑制AMPK/mTOR通路激活,降低海马神经元自噬及凋亡进程,发挥抗HIE脑损伤作用。     

Suppressive effect of Aurantii Fructus Immaturus and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma on glutamic acid-induced autophagy of interstitial cells of Cajal

ObjectiveTo investigate the effects of Aurantii Fructus Immaturus (Zhishi, ZS) and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma (Baizhu, BZ)-containing serum on glutamate-induced autophagy in rat colonic interstitial cells of Cajal (ICCs) and to analyze the underlying mechanism.MethodsRat colonic ICCs cultured in vitro were identified by fluorescence and then stimulated with glutamic acid (5 mmol/L) for 24 h to establish a cell model of autophagy. The cells were then treated with different concentrations of ZSBZ-containing serum or rat serum. The viability of the ICCs was detected with cell counting kit-8 assays, and cell apoptosis rates were examined with flow cytometry. The ultrastructure and autophagosomes in the ICCs were observed using transmission electron microscopy. The effects of ZSBZ-containing serum on apoptosis-associated mediators were assessed by Western blotting and real-time quantitative polymerase chain reaction. In addition, microtubule-associated protein light chain 3 (LC3), p-phosphoinositide 3-kinase (p-PI3K), p-Akt and p-mammalian target of rapamycin (p-mTOR) expression was detected via Western blotting analysis.ResultsCompared to those in the model group, ICC viability and apoptosis rates were significantly increased by ZSBZ-containing serum (P < 0.05). In addition, the expression levels of Beclin-1, LC3, p-PI3K, p-Akt and p-mTOR were significantly lower (P < 0.05) and Bcl-2 expression was higher in the ZSBZ-containing serum treatment groups than in the model group (P < 0.05).ConclusionOur findings demonstrated that ZSBZ protects glutamic acid-stimulated ICCs, and this beneficial effect may be mediated by a reduction in autophagy via inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway.     

蠲痛饮对子宫内膜异位症大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的影响

目的:探讨蠲痛饮对子宫内膜异位症(EMS)大鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶分子(mTOR)信号通路蛋白的影响。方法:采用自体子宫内膜移植法建立EMS大鼠模型,随机将48只大鼠分为正常组、模型组、蠲痛饮低、中、高剂量组、通路阻滞剂组(LY294002) 6组,分别给予蠲痛饮高、中、低剂量(42. 9,14. 3,4. 8 g·kg~(-1))灌胃,通路阻滞剂组予PI3K通路阻滞剂LY294002(0. 04 g·kg~(-1))腹腔注射,正常组及模型组每天按照10 mL·kg~(-1)给予生理盐水灌胃,各组持续用药28 d。应用透射电镜观察大鼠异位内膜组织超微结构,免疫组化法检测异位内膜组织PI3K,Akt,mTOR蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测核糖体蛋白S6激酶(p70S6K) mRNA相对含量。结果:与正常组比较,模型组异位内膜PI3K,Akt,mTOR蛋白和p70S6K mRNA的表达都明显升高(P 0. 05);与模型组比较,蠲痛饮中、高剂量、通路阻滞剂组干预后PI3K,Akt,mTOR蛋白和p70S6K mRNA的表达明显降低(P 0. 05)。透射电镜下可见蠲痛饮低、中、高剂量组和通路阻滞剂组均能促进腺上皮细胞萎缩或欠整齐,微绒毛减少或消失,胞核固缩,胞内线粒体肿胀或减少,间质细胞凋亡。结论:PI3K/Akt/mTOR信号通路参与子宫内膜异位症发生;蠲痛饮可能通过下调PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达及p70S6K mRNA表达,从而抑制上皮间质细胞活性,促进细胞凋亡,治疗子宫内膜异位症。